PCR技术检测金黄色葡萄球菌的研究.docVIP

计划编号： 国家质检总局项目 项 目 名 称：单 位： 起 止 时 间： 项目负责人： （签名） 填 表 日 期： 年 月 日 填 报 说 明 一、《国家质检局科技项目书》各项内容要实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨。 二、原件一式三份，由项目单位填写并经直属单位、直属检验检疫局及省质量技术监督局签署意见后，报送国家质检总局科技管理处。未盖公章者，不予受理。 、书中编号和国家质检总局科技主管部门审批意见由国家质检总局科技主管部门填写。 一、研究的目的、意义 食品安全是一个全球性重大问题。其中，食物中毒是影响食品安全性的一个重要因素。据国内外统计，在各种食物中毒中，细菌性食物中毒最多。研究表明，金黄色葡萄球菌根据金黄色葡萄球菌序列设计引物，建立起方便、快速的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，可以产生多种致病因子，包括溶血毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、脱氧核糖核酸酶、肠毒素及溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。它们通过损伤血小板，破坏溶酶体，破坏人的白细胞和巨噬细胞，阻碍吞噬细胞的吞噬作用及沉积或凝固血液或血浆中的纤维蛋白等方式，引起肌体局部缺血和坏死或急性胃肠炎等多种机体病变。主要依赖于免疫学技术，食品卫生学和临床诊断的原始样品，一般不是纯菌株的培养物，且混有大量的杂菌，常规鉴定方法通常要从样品中进行纯培养，步骤繁多，实验周期延长，使其在食品卫生学鉴定时受到限制近年来PCR技术的发展为食品中病原微生物的鉴定提供了新的途径。由于金黄色葡萄球菌外毒素基因位于金黄色葡萄球菌基因组上，以制备的基因组DNA为模板，根据金黄色葡萄球菌外毒素基因序列设计引物，建立起金黄色葡萄球菌外毒素基因的PCR鉴定技术，在可以鉴定出食品中是否存在金黄色葡萄球菌。 注：科技查新结果见附件（查新报告） 三、研究内容及预期达到的最终目标（主要技术、经济指标与研究结果） 本研究主要包括以下几方面内容： 1、探寻从乳样品中直接提取金黄色葡萄球菌DNA的有效方法，省略前增菌纯化步骤，并消除PCR反应抑制因子，以缩短检测时间和提高检测的准确性。 检测样品DNA模板的精确获取技术是食品中致病微生物快速检测研究的瓶颈，此项研究将为食品中致病微生物快速检测技术的发展提供有力支撑。 2、采用编码产毒金黄色葡萄球菌共有的耐热核酸酶（Tnase）的基因nuc作为靶基因，设计引物，以提高此检测方法的通用性。 耐热核酸酶（Tnase）为产毒金黄色葡萄球菌之典型特征，此酶非常耐热，在100℃加热30min，不易丧失活性。而编码耐热核酸酶的基因nuc为致病金黄色葡萄球菌所特有的并且是高度保守的基因，因而以耐热核酸酶的基因nuc为靶序列，进行PCR扩增是检测金黄色葡萄球菌的有效手段。 3、摸索并优化PCR反应条件，以建立一种适用于乳品等行业鉴定金黄色葡萄球菌的方便、可靠、快速的检测方法，制作出专适于乳品行业鉴定金黄色葡萄球菌的快速检测试剂盒。 本研究预计取得以下研究结果： 1、从乳样品中直接提取金黄色葡萄球菌DNA的有效方法。 2、建立一种适用于乳品行业鉴定金黄色葡萄球菌的方便、可靠、快速的检测方法，制作出专适于乳品行业鉴定金黄色葡萄球菌的快速检测试剂盒。 3、初步建立以乳源为主的金黄色葡萄球菌菌种数据库； 4、在国内期刊发表文章3-4篇。 项目完成后拟提交的样品(样机)、技术文件及相关资料清单 1、从乳样品中直接提取金黄色葡萄球菌DNA模板的试剂配方及操作方法； 2、专适于乳品行业鉴定金黄色葡萄球菌的快速检测试剂盒的试剂配方及操作方法； 3、以乳源为主的金黄色葡萄球菌菌种数据库的菌株清单； 4、3-4篇国内期刊发表的文章清单。 四、采用的研究、试验方法和技术路线（包括工艺流程） 提取各个标准菌株 的基因组DNA ↓ 采用标准金黄色葡萄球菌菌株 对设定引物的PCR反应条件 进行选择和优化 ↓ 用表皮葡萄球菌、 木糖葡萄球菌、 甲型溶血性链球菌、 乙型溶血性链球菌、 蜡样芽胞杆菌作对照 进行PCR扩增 检测引物对 金黄色葡萄球菌特异性 ↓ ↓——————————↓ ↓ ↓ 采用标准金黄色葡萄球菌菌株 采用生理生化的方法 探寻从乳样品中直接获取 乳中金黄色葡萄球菌分离 ↓ ↓ ↓ 用设计引物进行PCR扩增 ↓ 检测引物