高效液相色谱原理和操作详解.doc

高 效 液 相 色 谱 我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表： 方法 项目 数量 1985年版 1990年版 1995年版 2000年版 HPLC法 鉴别 9 34 150 检查 12 40 160 含量测定 7 60 117 387 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。 I．概论 2 一、液相色谱理论发展简况 2 二、HPLC的特点和优点 2 三、色谱法分类 3 四、色谱分离原理 3 II．基本概念和理论 5 一、基本概念和术语 5 二、塔板理论 8 三、速率理论（又称随机模型理论） 9 III．HPLC系统 10 一、输液泵 11 二、进样器 13 三、色谱柱 14 四、检测器 17 五、数据处理和计算机控制系统 20 六、恒温装置 20 IV．固定相和流动相 20 一、基质（担体） 20 二、化学键合固定相 22 三、流动相 23 1．流动相的性质要求 23 2．流动相的选择 24 3．流动相的pH值 24 4．流动相的脱气 25 5．流动相的滤过 25 6．流动相的贮存 26 7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 26 8．HPLC用水 26 V．HPLC应用 27 一、样品测定 27 二、方法研究 27 附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 28 一、对起草单位的要求： 28 二、对复核单位的要求： 28 I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 三、色谱法分类 按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。 按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。（此外还有电泳。） 按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。 四、色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法