3-3章分子杂交技术.ppt.ppt

2. DNA定序的一般程序 酶法测序(Sanger) 化学测序法(Maxam-Gilbert) 待测DNA片段 待测DNA片段 ↓ ↓ 次克隆 5’-末端标记 ↓ 筛选重组子 链分离 限制酶切 ↓ 模板增殖与纯化 ↓ ↓ 纯化标记的ss-DNA 与引物退火 ↓ ↓ 定序反应 定序反应 ↓ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 真空干燥 ↓ 放射自显影 ↓ 阅读序列和计算机录入 ↓ 核苷酸序列的分析与比较 3. 两种定序方法的比较 1) 化学法 i. 优点: 所有片段具有相同的标记强度；一次可以读出250-400个核苷酸；定序分析不需要次克隆；不受二级结构区的影响；多A区定序清楚；适合500bp或以下DNA片段的定序分析。 ii. 缺点: 需限制酶图；需放射自显影时间较长和增感屏；DNA片段需经凝胶纯化； 多嘧啶区定序不够清楚；所用试剂为诱变剂和致癌物质。 2) 酶法 i.优点: 反应简单，易于操作；具有配套载体和宿主菌；不一定需要详尽的限制酶图；可采用多种方法进行次克隆。 ii.缺点: DNA带放射强度不均匀；下游碱基阅读困难；需要大量的次克隆和鉴定工作；二级结构区和多C区定序困难。 定序方法的选择主要依据所需测序DNA长度，实验目的等。 * * 第七节 分子杂交技术 一. 分子杂交种类 1. 按其分子种类划分 1） DNA杂交—探针为DNA或RNA 2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA 3） 蛋白质免疫分析—探针为抗体 2. 按样品制备过程划分 1） 原位杂交(in situ hybridization) i. 原位菌落杂交 ii. 原位噬菌斑杂交