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页面设置：纸张为A4，页边距——上下左右均为2cm。每行45字，每页46行。 正文字体：五号宋体 一级标题：小四黑体 二级标题：五号黑体 三级标题：五号楷体 经典碱裂解法质粒大量提取方法的改良 孟雨1，李静2，李小丹1* (1.黑龙江八一农垦大学大庆 163319) 摘 要：利用滤膜过滤技术对经典碱裂解法进行改良，并将改良后的提取效果与经典碱裂解法和试剂盒法进行比较。结果表明改良提取的质粒DNA浓度显著高于经典碱裂解法和试剂盒法，并且质粒纯度与试剂盒相近。改良方法适用于实验室的应用与推广。关键词：碱裂解法；质粒DNA；提取与纯化；滤膜过滤中图分类号Q78 文献标识码：A The Modification of Traditional Alkaline Lysis Method for Plasmid DNA Extraction Meng Yu1,Li Jing2, Li Xiaodan1 (1.Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319；2. College of Agriculture, Northeast Agricultural University) Abstract: The membrane filter technique was used to modify the traditional alkaline lysis method.Comparing the effect of extraction of the modified method with traditional alkaline lysis method and reagent kit method, the results showed that the plasmid DNA isolated and purified by this method had higher concentration than the other two methods, and had similar purity with the reagent kit method. Therefore the method was more suitable for the laboratory extraction and purification of plasmid DNA for a large scale. Key words: alkali lysis; plasmid DNA; isolation and purification; membrane filter 一般细胞转染等特定实验需要高浓度及高纯度的质粒DNA, 且要求DNA的A260/A280值应控制在1.8～2.0之间。虽然近些年来质粒大量提取试剂盒层出不穷，但大多费用较高，所以目前大多实验室仍以传统的手提方法为主，其中以萨姆布鲁克[1-2]提出的经典碱裂解法应用的最为广泛。但此方法却仍存在诸多弊端，例如操作复杂、耗时、所得质粒纯度低等，尤其是多次使用有机溶剂容易造成质粒DNA的污染，且易对实验人员构成危害，实验废液也会造成不同程度的环境污染[2]。因此本实验室在经典的碱裂解法基础上，采用物理方法替代化学方法去除蛋白质，从而避免了酚、氯仿等有机溶剂对实验者的危害和对环境的污染，并且对改良前后的碱裂解法及试剂盒法所制备的质粒DNA的效果进行比较。 1 材料和方法 1.1 菌株 大肠杆菌DH5α 1.2 主要试剂仪器 主要试剂:溶液Ⅰ：10 mmolL-1 Tris-HCl,pH7.5,50 mmol·L-1 EDTA, pH8.0；灭菌后,4℃保存。溶液Ⅱ:1%SDS，0.2 molL-1 NaOH；现配现用，2%SDS，0.4 molL-1 NaOH母液等体积混均即可。溶液Ⅲ 1.32 molL-1醋酸钾，pH 4.8,用醋酸调节pH值。灭菌后，4 ℃保存。 STE溶液。含RNaseA 20μgmL-1的 TE溶液。琼脂糖。质粒大量提取试剂盒。 主要仪器0.2 μm滤膜，电泳仪DYY–8B型稳压稳流电泳仪, 核酸蛋白定量仪， Gel Doc 2000紫外凝胶成像仪系统,DK-S12电热恒温水浴锅大提试剂盒法:依照试剂盒说明书的步骤提取质粒DNA。 经典碱裂解法:提取方法主要按文献[1]进行。 改良的碱裂解法:（1）挑取单菌落于含Amp抗生素的LB液体培养基中，37 ℃120rpm摇菌过夜，至OD值为0.6，取50 mL菌液在冰上预冷10 min，5 000rpm离心10 min，尽量吸除上清；（2）重复步骤（