蛋白质杂交选读.ppt

Western blot 实验技术 定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 蛋白样品的制备 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 1.水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。盐析沉淀出的蛋白质一般保持着天然构象。常用的中性盐是硫酸铵。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 2.低温有机溶剂提取法 蛋白质处在一定量的有机溶剂中，分子间极性基团的静电引力增强，水化作用降低，蛋白质聚集而沉淀。对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。该法沉淀蛋白质的选择性较高，不需脱盐。 3.水溶性多聚物沉淀法 聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（DEX）等溶于水中，蛋白质的极性基团与多聚物分子中的氧或氢氧根结合，形成二者的复合体，从溶液中沉淀析出。改变多聚物的浓度可分段沉淀出不同的蛋白质。 4. 通过层析或电洗脱法、色谱等制备目的蛋白 重组蛋白的特点： 目的蛋白质的量较多，至少点总蛋白量的1%，常为5%-9%，使纯化易于进行。 可利用融合蛋白质的特性进行纯化。利用标示物（tag）的特性，用亲合层析柱，可快速分离纯化融合蛋白质，最后切除tag即可。很多表达载体已带有tag的DNA序列。 重组蛋白的特点： 包含体的形成。主要出现在大肠杆菌等原核生物中，溶解度很小的蛋白都进入包含体中，包含体中的蛋白质主要是外来性的重组蛋白。离心的方法先收集包含体，再从中分离蛋白。 分泌蛋白质的生成。目的蛋白前加入信号肽序列，可使真核细胞内表达的蛋白分泌到培养基中，因其中的蛋白质种类较少而使目的蛋白的分离纯化得以简化。大肠杆菌等有细胞壁的细胞可分泌至周质中，收集细胞后，改变渗透压，同时加入少量溶菌酶破坏细胞壁，提取周质后，纯化目的蛋白。 蛋白样品的定量 生物化学所学的方法都可以。凯氏定氮法、双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法。 凯氏定氮法：蛋白质中氮在浓硫酸作用下生成铵盐，与浓NaOH作用，产生氨气，吸收于标准硼酸溶液中，用标准酸直接滴定，测出含氮量，按蛋白质恒定的含氮量（16%），换算出蛋白的含量。 福林-酚法（Lowry法）：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸残基与Cu2+结合，生成复合物，进而还原酚试剂的磷钼酸，生成蓝色化合物，用比色法测定。 蛋白样品的定量 紫外吸收法：蛋白质在280nm左右有吸收高峰（因色氨酸和酪氨酸的吸收），不同的蛋白，其中色氨酸和酪氨酸的含量各异，因此A280值不同。 Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量) 其他商品化的试剂盒也可测蛋白含量。 蛋白样品的定量 试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： 蛋白质进行PAGE时，其迁移率取决于所带的净电荷量以及分子的大小、形状等因素。如在胶中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白分子中的二硫键还原。 SDS使蛋白的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。大量的SDS结合后，各种蛋白都带上相同的负电荷，大大超过了蛋白原有的电荷量，因而原有的电荷差别可忽略。所以，蛋白质的迁移率主