第四讲-微生物遗传选读.ppt

酵母双杂交模型 文库筛选的步骤 将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒 将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母 再将文库质粒转化到酵母中 通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白 序列分析 从酵母中分离质粒然后转化E. coli 从大肠杆菌中提取质粒并测序 在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性 报告基因 LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity) LEU2 reporter - Screen on Leu+ media ADE2 reporter - Screen on Ade+ media URA3 reporter - Screen on Ura+ media (can do negative selection by adding FOA) 质粒构建 在Gal4（或其他合适的蛋白功能域）的 DNA结合域前面的多克隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒 诱饵质粒含有筛选基因，例如氨苄青霉素抗性基因，Leu2, Ura3, or Trp1等。 质粒样品 URA3 plasmid URA3 PCR product Linear DNA, ready for yeast transformation and integration yfg Homologous Recombination Yeast Chromosome URA3 Integration (yfg is now disrupted) Yeast Chromosome URA3 Targeted Gene-disruption (Conted) Homologous recombination is very efficient in yeast. Is the knock-out strain viable? What is the phenotype of a strain without the gene of interest? The Yeast Two-Hybrid System 酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。 酵母双杂交及其衍生系统是鉴定及分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用的最常用、最有效的工具之一。 一、酵母双杂交系统原理 转录激活因子在结构上是组件式的（modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域（DNA binding domain，简称为DB）和转录激活结构域（activation domain，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。 Why we care about protein-protein interaction??? AD DBD gene + reporter Measurable product + DBD bait AD fish DBD AD DNA-Binding Domain Bait Protein Prey Protein Transcription activating region Reporter Gene DNA-Binding Site nucleus his- leu- trp- Yeast 2-Hybrid Assay Measurable product DBD bait trp AD fish leu reporter DBD AD his HIS lacZ Yeast two-hybrid assay * Mutagenesis Conventional mutagenesis* 2. Screen through the knock-out collection Need to test whether the phenotype of interest is due to a single mutation - tetrad analysis. Yeast nomenclature using the ARG2 locus as an example Gene symbol Definition ARG2