泰妙菌素摇瓶发酵工艺优化研究.doc

泰妙菌素摇瓶发酵工艺优化研究 吴(致军 张萍 王果 沙艳玲 （宁夏多维药业有限公司菌种研究所，银川 750006） [收稿日期] 2008-8-25 [文献标识码] [文章编号] [中图分类号] [摘要]：泰妙菌素菌种采用正交实验设计对摇瓶发酵配方进行了优化, 使得摇瓶效价(指发酵液中截短侧耳素含量)从4992μg/mL提高到了9850μg/mL ，效价提高了97.32%,并对摇瓶发酵工艺进行了多方面摸索和调整，完成了引进泰妙菌素菌种的消化吸收。 [关键词]：摇瓶效价；优化；正交实验设计 抗生素菌种的摇瓶效价是标志菌种生产能力的重要指标，不仅是验证该菌种种子阶段菌种制备是否正常的依据，而且也是菌种选育过程中用到的首要指标。菌种摇瓶效价正常与否，不仅影响原材料验证、工艺调整和正常生产；而且也决定菌种选育的成与败。为此，我们对种子瓶制备中的菌丝铲取量多少及研磨程度进行研究，用正交实验设计对摇瓶发酵配方进行了优化[1-2]，使得摇瓶效价在原工艺的基础上提高了97.32%,达到9850μg/mL，同时对发酵瓶的接种量、通气量及培养周期对摇瓶效价的影响进行了深入研究[3]，完成了引进菌种的消化吸收工作。 材料与方法： 1.1 菌种：L2宁夏多维药业有限公司国外引进。 1.2 仪器设备：Waters 600高效液相色谱仪（2487型紫外检测器），美国Waters 公司;TDL-5-A型台式离心机;JA203型电子天平，上海海康电子仪器厂;pHS-3C精密pH计,上海精密科学仪器有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱,上海博迅实业有限公司医疗设备厂；CX31RBSF型显微镜,菲律宾奥林巴克公司;组织研磨器以及其它实验室常用的仪器设备。 1.3 原材料：葡萄糖,天京市瑞金特化学品有限公司;玉米浆,华北制药康欣有限 公司;酵母膏,北京奥博星生物技术有限责任公司;黄豆粉，银川市荷兰县豆饼粉厂；豆油，西安邦琪油脂公司；MgSO4·7H2O,天津市大茂化学试剂厂；Ca(NO3)2·4H2O, 天津市大茂化学试剂厂；KH2PO4,天津市永大化学试剂开发中心；NaCl,天津市化学试剂六厂。 1.4试剂和溶液： 甲醇：色谱纯 乙腈：色谱纯 水： 纯化水 氢氧化钾：分析纯 0.02mol/L磷酸缓冲液：称取2.72g磷酸氢二钾到950mL纯化水中，用5%氢氧化钾溶液调pH＝7.2，将溶液移至1000mL容量瓶，并用纯化水稀释至刻度。 截短侧耳素标准样品：已知含量≥95.0% 1.5仪器： 高效液相色谱仪：Waters 2695/2487 色谱柱：Waters 4.6×250mm不锈钢柱， 5μm Symmetry C18 1.6效价测定方法： 截短侧耳素是一种二萜烯类抗生素,从截短侧耳素经半合成可得到延胡索酸泰妙菌素。1.6.1操作条件： 流动相为甲醇-1%碳酸铵溶液（6:4，V/V）；流速：1.0mL/min；检测波长：212nm；进样量：20μL。截短侧耳素8.02min 1.6.2标准样液的制备： 称取0.02g标准品，于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀即得标准样液。 1.6.3试样测定液的制备： 取发酵液2mL，于100mL浸提瓶中，加入18mL甲醇，用胶塞塞上瓶口，在240转/分的摇床上振荡3h后过滤，用一次性注射器吸取2mL滤液，用针头过滤器（0.45μm）mL吸管吸取0.2mL接种茄瓶斜面，置温度25℃，湿度50- 55%的培养箱中培养10-12天后，将其保存在4℃冰箱中备用。 1.8 种子瓶菌丝的制备：用无菌的不锈钢铲在无菌条件下铲取2cm2左右的菌丝体，加入组织研磨器，加入4mL无菌水充分研磨后以10%的接种量接种种子瓶，置温度25℃，湿度40-50% ,转速为240转/分钟的摇瓶机上振荡培养 48–72h，用于转接发酵瓶。 1.9 发酵瓶的培养：用培养好的种子瓶菌丝，以10%的接种量转接发酵瓶，置温度25℃，湿度40-50% ,转速为240转/分钟的摇瓶机上振荡培养192h左右放瓶。 2. 结果 2.1 菌丝量多少及研磨程度对种子瓶生长的影响 泰妙菌素在种子瓶制备过程中需要将菌丝用组织研磨器研磨，由于按照原工艺操作，经常出现种子瓶菌丝生长缓慢，或生长不良的现象，直接影响实验进度和生产进度。为了解决这一问题，我们对菌丝铲取量和研磨程度作了比较，用同一只斜面分别铲取2cm2左右 和8cm2左右（原工艺要求）,各重复4个平行样，用同一型号的组织研磨器研磨5min,然后接种种子瓶，在240转/分钟摇床上,25℃振荡培养72h，统一测定pH,菌丝浓度（测定方法为：称取