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生物芯片技术及其发展 一、生物芯片的定义 生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray)。 生物芯片包括DNA芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。 1998年世界十大科技突破之一。 未来十年最具发展潜力的技术。 二、特 点 1.高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。 2.多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。 3.微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。 4.自动化：降低成本，保证质量。 三、生物芯片分类 尚未统一。广义上：矩阵型芯片、处理型芯片。根据固化材料可分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片 1.分类（根据应用） 1）基因变异检测芯片 疾病检测(如HIV、P53基因、结核杆菌) 法医鉴定(如DNA指纹图谱) 2）表达谱芯片 肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表达差异) 药物筛选(培养细胞药物刺激前后表达差异) 发育(同一组织不同发育时期基因表达差异) 组织发生(不同组织或器官的基因表达差异) 2.根据工艺和载体 1）原位合成法：密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸，但特异性较差，寡聚核苷酸合成长度有限，且随长度增加，合成错误率增高。成本较高，设计和制造较烦琐费时。 2）DNA微矩阵法：成本低，易操作，点样密度通常能满足需要。芯片的载体需表面紧质、光滑的固体，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩阵芯片常用玻片为载体。 3.根据DNA成分 1）寡聚核苷酸或DNA片段：约20(25个核苷酸碱基，常用于基因类型的分析，如突变、正常变异（多态性）。 2）全部或部分cDNA：约500(5000个核苷酸碱基，通常用于两种或以上样本的相关基因表达分析。 四、生物芯片技术主要环节 1.芯片制备：微点阵 2.样本制备：DNA提纯、扩增、标记 3.杂交：样本与互补模板形成双链 4.检测：共聚焦扫描，双色激光 5.数据处理：定量软件，数据库检索，RNA印迹等。 6.结果 五、生物芯片分析的原则 1、测定过程应包括五个基本步骤： 需解决的生物学问题 样本制备 生物化学反应 检测 数据分析 2 2、生物学系统控制必须精确地与检测目的相匹配。3、生物学样本必须精确地与生物学种类相匹配。4、所有基因分析必须平行处理。5、基因分析技术必须适合微型化和自动化。6、平行格式必须精确的依据生物学样本的次序。7、检测系统必须能精确地获得数据。8、检测系统获得的数据必须能被精确地控制和重复。 9、两种或以上平行数据组比较应受到单个实验所固有特性的限制。10、绝对比例关系只存在于组合实验的平 行数据组内。11、平行格式包括内在和外部的整个系统 误差的分析因素。12、在每个系统模块中采集到该系统所有 变量的四维数据时，才能称为完成生 物系统平行基因分析。 六、 芯片技术过程 （一）芯片制备 1.原位合成法（in situ synthesis):又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。 2.合成后交联（post-synthetic attachment):利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸或cDNA样品点在经特殊处理过的玻片或其他材料上。主要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中、低密度芯片的制备。 3.两种制备方法比较 1）原位合成：测序、查明点突变，根据已知的DNA编制程序设置高密度探针，但制作复杂、价格昂贵、不能测定未知DNA序列 2）合成后交联：比较分析。制备方式直接和简单，点样的样品可事先纯化， 交联方式多样，可设计和制备符合自己需要的芯片。中、低密度，样品浪费较多且 制备前需储存大量样品。 （二）样本制备 制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成分等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变化。 用于基因类型分析的样本是DNA，用于表达研究的样本是cDNA。 样本制备后应进行标记，通常为酶标记、荧光标记和核素标记。 （三）杂交 是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步 液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应。 选择杂交条件时，必须满足检测时的灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能保证每条探针都能与互补模板杂交。 合适长度的DNA有利于与探针杂交。 温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。 最好在封闭循环条件下杂交，杂交炉。 （四）结果分析 芯片与标记的靶DNA或RNA杂交后，或与标记的靶抗原或抗体结合后，可采用下 列方法分析处理数据： 1.共聚焦扫