细胞生物学方法-课稿.ppt

7. 超分辨率显微镜-2014Nobel agarose beads Antibody for A C B A B Western 检测C Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana 目的基因的分离和克隆 表达载体的构建 卵母细胞的收集 体外成熟培养 受精卵的鉴定、筛选 体外受精 基因导入 转基因动物 转基因胚胎的获得 受体动物的选择 转基因胚胎的移植 转基因整合表达的检测 获得转基因动物 * * * * * * * * * * * * Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish. Glioblastoma cells produce microvesicles containing RNA 50-500 nm Cilium 三、流式细胞仪 包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴； 激光束的照射下，细胞发出散射光和荧光 经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果 根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99% 应用：检测、分选 Cell sorting 分子生物学方法 PCR 分子克隆 转基因技术 基因敲除（knock-out） 基因敲低（knock-down） 原位杂交 酵母双杂交技术 Realtime-PCR 普通-PCR Induced pluripotent stem cell-2012诺奖 ? A The DNA-BD/protein X (bait) hybrid binds to the GAL1 UAS but cannot activate transcription without the activation domain (AD). Yeast Two-Hybrid In the absence of bait protein, the AD/library fusion protein cannot bind to the GAL 4 UAS and thus does not activate transcription. B Interaction between the bait and library proteins in vivo a activates transcription of The reporter gene. ? C 构建诱饵蛋白质粒(BD质粒) ↓ 检查BD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续) ↓ 文库质粒(AD质粒)转化带有BD质粒的酵母菌，铺 SD/四缺平板 ↓ 挑his+、ade+双阳性克隆作β-galactosidase分析，消除假阳性 ↓ β-gal分析阳性质粒在SD/四缺平板与摇管中传代，去除无效AD质粒 ↓ 传代阳性酵母质粒分离，转化大肠杆菌，获得大量阳性AD质粒 ↓ 检查AD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续) ↓ AD质粒转化带有BD质粒的酵母菌，再次验证其相互作用 ↓ 阳性AD质粒测序，按在酵母中读框方式进行蛋白同源性查询 ↙ ↘ 如果找到候选蛋白，克隆其 如果找不到候选蛋白，有可能 全基因，采用GST融合表达 是新基因，可进一步分析，设 技术和体外翻译技术在蛋白 计引物，克隆全基因并进一步验证 ↓ 基因在真核细胞中的表达及定位分析 ? 双杂交系统文库筛选过程流程图 免疫学方法 单克隆抗体技术 免疫化学染色 Western blot 免疫共沉淀 染色质免疫共沉淀 单克隆抗体技术 B淋巴细胞在抗原的刺激下分化成浆细胞产生抗体，每一个B细胞只能接受单一抗原刺激产生特异性抗体，即单克隆抗体。但B淋巴细胞不易在体外存活。 瘤细胞可以在体外培养生存并无限增殖，但不分泌特异抗体； 骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的B淋巴细胞融合，融合细胞既具有肿瘤细胞无限增殖的特性又具有B淋巴细胞分泌特异抗体的能力，融合细胞称为杂交瘤细胞。 免疫细胞化学染色 根据抗原与抗体特异性