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实验一、聚合酶链式反应-PCR 一、实验原理: PCR又称聚合酶链式反应,是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法,主要由 高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成:即在高温下, 待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温情况下,两 条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在 Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原 料,Mg2+存在下,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链。这样,每一双链 的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链 DNA分子。如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模 板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍, PCR产物得以指数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因 扩增数百万倍。 1.DNA模板:反应中DNA量在50ng~200ng左右。且DNA纯度较 高, 以增加反应特异性。 2.dNTP:反应体系中达100μM~200μM。 3.Mg2+:Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右,浓度太低 Taq酶活力降低;太高反应特异性降低。 4.引物:根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基 左右;G+C含量在40%-70%之间;引物内部不能有回该 序列;引物3’端不能互补。 5.Taq酶:它是从嗜热杆菌中提取的耐热性DNA聚合酶,在95℃时30分钟还有50%活力。 二、实验所需器材和试剂 器材: 台式高速离心机,恒温水浴锅,PCR扩增仪,琼脂糖 凝胶电泳系统,凝胶成像系统,Eppendorf离心管, PCR小管 试剂: 引物1,引物2,dNTP mix,10X PCR Buffer, Taq DNA 聚合酶,EB,上样缓冲液, marker,琼 脂糖,TBE缓冲液 三、实验步骤 1:加样 按次序在PCR小管中加入下列试剂(50ul体系): 5ul 10X PCR Buffer 4ul dNTP mix 2ul 引物1 2ul 引物2 3ul 模板 1ul Taq DNA polymerase 加水到总体积50ul 注意事项:同时设立对照组(对照组不加模板DNA) 2、按以下参数进行PCR扩增(对于不同的PCR反应应设置不同的反应条件) 94℃ 4分钟 94℃ 30秒 51℃ 30秒 进行30个循环 72℃ 30秒 72℃ 5分钟 4℃ 3、扩增结束后,取5ul产物进行琼脂糖凝胶电泳以观察结果 四、作业 1,图示实验结果 2,掌握PCR原理、学会分析实验结果 * * 说明 PCR过程示意图 将实验组与对照组放入PCR仪,按设定好的条件进行扩增 PCR结果示意图
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