生物化学技术补充1 吸收光谱分析法1幻灯片.pptVIP

* * * * 补充1 光谱检验技术 概念及分类 概念 利用各种化学物质具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定物质性质、结构或含量的技术 分类（根据物质对光谱响应特征的不同，可将其分为） 发射光谱分析技术 吸收光谱分析技术 散射光谱分析技术 在生化技术方面，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛；它既可以研究物质的结构，也可以对特定物质进行定性或定量分析 一、吸收光谱分析法 吸收光谱 是指波长连续分布的光透过物质时，某些波长的光被物质吸收而产生暗线或暗带组成的光谱 吸收光谱分析法 利用吸收光谱对物质进行定量的技术称为吸收光谱分析法，是实验室最常用的分析技术之一 特点 它操作简便、快速，线性范围较宽，应用广泛 分类 目前最常应用的技术有可见—紫外分光光度法和原子吸收分光光度法 (一)可见-紫外分光光度法 1.原理 L-B尔定律 （可见-紫外光区波长为200~760nm，其中200~400nm为紫外光） 2.方法 ①对比法 ②标准曲线法 3.排除干扰的方法 当两种或两种以上的组分共存时，可出现吸收光谱重叠的情况；测定某一组分时，其他组分对它会有不同程度的干扰，此时可采用双波长法排除杂质的干扰 吸收光谱相互重叠的a、b两组分。选择各自的测得波长λ1和λ2，使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相同，而欲测组分在两波长处的吸光系数有显著的区别。用这样两个波长测得混合物溶液的吸光度差值ΔA，只与欲测组分的浓度成正比，而不受共存组分的影响 在测得波长λ1和λ2处测得混合物的吸光度分别是A1a+b和A2a+b，则ΔAa+b=A1a+b - A2a+b = A1a + A1b–A2a–A2b =ΔAa +ΔAb 因组分a在λ1和λ2处的吸光系数相等，即 欲测组分b在两波长处的吸光系数相差愈大，则灵敏度愈高。用双波长法还能消除样品溶液背景吸收的干扰和混浊的干扰，提高测定的准确性。近年来由于新的、灵敏度高、选择性好的显色剂和掩蔽剂不断出现，一般不经分离过程即可直接比色测定；还可采用联立方程法、等吸收点法等解决定量中的干扰问题 3.分光光度计的光源检查和波长校正 (1)光源检查即波长的初步检查 不论何种分光光度计在校正之前都要先检查光源。检查方法是将波长选定在580nm处，将狭缝开到最大(或打开光门)，打开钨灯，在比色皿内插一白纸片。光源正常时，应看到均匀的黄色光斑，边缘清晰整齐；如果明暗不匀，形状异常，则应调节光源灯的位置 常用的方法有 ①用含某些特定元素的玻璃来较正 最常用的有镨钕玻璃、钬玻璃等。校正时将这种玻璃放在比色皿座上，以空气调0，测定几个吸收峰值的波长是否相符。如最常用的测定镨钕滤光片在585nm的杂光水平应在5%以内 ②可利用某些标准溶液进行校正 如标准重铬酸钾溶液(在1000ml的0.05mol／L的KOH溶液中溶解0.0400g纯重铬酸钾．(K2CrO4))，在25℃以1cm比色皿在各波长测定其标准吸光度，如表2~1。重铬酸钾溶液的优点是在紫外区270nm及370nm处有两个最大吸收 (2)波长校正 (二)原子吸收分光光度法 1.原理 基于光源辐射出具有待测元素特征谱线的光，通过原子化器被其中待测元素的基态原子所吸收，根据吸收而导致辐射特征谱线光被减弱的程度来测定待测元素的含量 2.方法 标准曲 线法、直接比较法和标准加入法 主要用于钙、镁、铜、铅、锌等微量元素的测定 3.原子吸收分光光度计结构特点 有单光束型和双光束型两类。主要由光源、原子化器、单色器和检测系统组成 在微量元素测定中，首先根据有关资料了解仪器待测元素的灵敏度和检出限 ①对灵敏度达不到要求的可以选择最灵敏的吸收线，选用小的狭缝宽度，采用较小的灯电流和最佳火焰类型及状态等来提高灵敏度 ②测定物质溶解后干扰要小，易于喷雾和原子化，稀释后测定结果应在线性范围内 ③仪器通电后要预热30min，使光源的发射稳定。狭缝的宽度影响光的谱带宽度与检测器的接受能量，使用较宽的狭缝可以增加光强度，提高信噪比，改善检出限 ④当吸收线附近有干扰谱线与非吸收光存在时，使用较宽的狭缝会降低灵敏度。在火焰化法中，火焰的类型是影响原子化效率的主要因素。因此，需通过调节燃气与助燃气的流量获得最佳原子化条件，以达到最高的测定灵敏度 总之，一种元素的原子吸收法测定需要考虑仪器工作的各种条件，以期达到实验的最佳结果 二、发射光谱分析法 基本概念 荧光 某些物质吸收了一定波长的光能后，独自从基态跃迁到激发态，此类分子经与同类或其他类分子相互碰撞，消耗相当，而下降至第一电子激发态的最