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DNA重排检测方法.ppt
DNA发生重排后,其扩增产物条带与正常的有差异,由此可以检测DNA重排 淋巴瘤诊断: 淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果,其特殊的基因重排形式占一定的数量优势,从而成为细胞克隆性的检测指标。选取IgH与TCR(T细胞受体)的V、D、J、C区基因编码中20 个左右的保守核苷酸序列,人工合成一对或多对(家族基因)引物,以待测样品DNA为模板,扩增目的DNA序列片段。如果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。而良性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状, 2. 常规PCR技术 不形成单带。 转基因材料外源基因的检测 1,标准分子量;2,质粒;3,对照;4-8,转基因植株 1 2 3 4 5 6 7 8 转基因黑麦草PCR检测外源Ubi启动子 (1) PCR-RFLP: 多聚酶链反应(PCR)--限制性片段长度多态性 (restriction fragment length Polymorphism,RFLP) 原理:PCR产物-限制性内切酶切-多态性分 析,DNA发生重排后,酶切位点发生改变。 优点:具有分辩率高,无需标记,重复性好, 简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析 与比较, 微生物的分群分型分亚型,癌基因 分析,遗传病的诊断等。 局限:只能应用突变引起限制性酶切位点改变 的情况下,一次只能完成一个特定位点突变 筛选,检测效率低。 3. PCR相关技术 PCR-RFLP原理示意 原理:是将经扩增的DNA片段经过变性处理,形成单链,由于序列不同,单链构象就有差异,在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同,通过与标准物的对比,即可检测出有无变异。 刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中,通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNA带型,大大降低了成本,具有经济、快速、灵敏等特点。1993年起用EB染色法显示DNA带型,使得SSCP操作更简单,更经济,更迅速。 (2)PCR-SSCP:聚合酶链反应一单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism) * * DNA重排的检测方法 马欣荣 高方远 康海歧 一、形态学观察 二、细胞遗传学 如:染色体核型分析、染色体显带等 三、分子细胞遗传学 如:荧光原位杂交 四、分子生物学 如: Southern杂交,PCR及相关技术等 一、形态学观察 例子: 上个世纪40年代科学家B.McClintock 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基本改变引起的,从而导致转座子的发现。 肿瘤细胞与正常细胞 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍,遗 传结构的改变引起表型的改变。因此从 形态学上可以鉴定肿瘤。 二、细胞遗传学 染色体核型分析、染色体显带 一个物种的染色体核型及带型是稳定的 染色体核型分析:观察中期染色体,初步分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、易位、及附加 常规核型分析 荧光核型分析 光谱核型分析(Spectral karyotyping, SKY) 光谱核型分析原理(Spectral karyotyping, SKY) 1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。应用5种荧光素同时标记24条人染色体,制成染色体涂染探针,应用Fourier光谱仪,CC成像和荧光显微镜进行检测分析,经计算成像处理,46条染色体形成具有不同颜色的核型影像,可用以分析各种染色体异常。 优势: 特异性和分辨率比传统的显带技术高,它 可以检测到 1.5mb 碱基的转位 一次杂交即可分辨人的24条染色体 人染色体光谱核型分析 乳腺癌细胞染色体复杂的畸变 2.染色体显带技术: C-banding 主要染异染色质 R-banding 与C-banding 相反,主要染常 染色质区域 G-banding 是Giemsa 染色结果,产生深 浅不同的条带 Q-banding 是用喹丫因(quinacrine)染 色得到的荧光条带,带型与G带相似 G-带 c. 正常染色体 末端缺失 d. 末端倒位 末端单向易位 e. 着丝粒周倒位 G-带显示人急性骨髓白血病异常染色体 9、10、11染色体间易位,右为异常染色体 三、分子细胞遗传学 原位杂交(In situ hybridisation) 标记的核酸探针变性后与已变性的靶核酸在退火
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