β-防御素1基因多态性与重症脓毒症真菌易感性的相关性研究.doc

β-防御素1基因多态性与重症脓毒症真菌易感性的相关性研究 谢郭豪1 王海宏2 吕 晨3 黄丽霞4 陈齐兴1 方向明1 1.浙江大学医学院附属第一医院 2.浙江大学医学院附属邵逸夫医院 3.浙江省中医院 4.杭州市红十字会医院 【摘要】目的通过病例对照关联研究，β-防御素1（DEFB1）基因多态性与重症脓毒症患者真菌感染易感性。方法依据1992年和2002年美国胸科医师协会/美国危重病学会（ACCM/SCCM）联会议的脓毒症定义，重症监护病房（ICU）符合重症脓毒症标准的患者聚合酶反应双引物等位基因特异性扩增法(PCR-ASA)单倍型Fisher精确概率法分析与重症脓毒症易感性的相关性。结果基因型分布和等位基因频率在组和对照组之间无显著性差异（所有 p0.05）。常见单倍型ACG, ATGCA, GTGGG和ATACG在组和对照组之间的分布频率无统计学差异（所有p0.05）。研究结论关键词脓毒症；；；关联研究防御素(defensin)在人和动物体内参与机体防御的阳离子抗菌肽(cationic antimicrobial peptides)分子量为4.0(5.0KD、含有六个半胱氨酸残基和三对二硫键，根据多肽内二硫键排列顺序不同，分为(-防御素和(-防御素两个家族-防御素多肽在机体抗感染的天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥非常重要作用。人β-防御素1是最早发现的β-防御素，主要表达于皮肤、泌尿生殖道、呼吸道等上皮和腺体组织中，具有较强的广谱抗菌活性，能够直接杀死G+和G-菌、真菌、包膜病毒等多种病原微生物，并且可以趋化诱导幼稚树突状细胞和记忆T细胞聚集到炎症部位 介导幼稚树突状细胞的成熟，进而活化T细胞，触发体内强有力的特异性免疫应答β防御素1可以被LPS、IL-1β等炎症刺激因子诱导表达升高，并且脓毒症和感染性疾病病人体内β-防御素1水平增加。同时也发现β-防御素1诱导表达水平在不同个体之间也存在明显差异[3-5]。 由于防御素家族成员的生物学功能交互重叠，应用敲除单个防御素基因的动物模型研究防御素分子的在疾病中的作用存在较大的困难。遗传关联分析法分析基因多态性与某一疾病发生发展的相关性已成为研究该基因在这一疾病的病理生理过程中作用的常用方法。既往的遗传关联分析研究已发现β-防御素1Jurevic RJ等研究发现DEFB1基因SNP-44C/G与Ⅰ型糖尿病患者口腔念珠菌感染相关[12]。但是关于DEFB1基因多态性与脓毒症人群真菌易感性的关系目前还没有报道。本研究将通过病例-对照关联分析研究方法采用PCR-ASA、TaqMan方法汉族人群重症脓毒症和的，探与重症脓毒症相关性，为深入探究在脓毒症作用、寻找脓毒症的高危遗传标志。1.1.1 主要试剂 QIAamp DNA Blood Mini DNA提取试剂盒（QIAGEN公司） QIAquick 96 PCR Purification试剂盒热启动Taq DNA聚合酶：（含10×buffer和10mM dNTP）TaKaRa公司 Agarose琼脂糖（上海日初生物科技有限公司） 溴化乙锭（Ethidium bromide，EB）（上海贝基生物科技有限公司） 5×TAE液pUC Mix Marker SM0301(上海世泽生物科技有限公司) 1.1.2 主要仪器设备 Eppendorf移液枪（1000ul、100ul、10ul）（Eppendorf公司Eppendorf管（1.5ml、0.5ml）(上海生工生物工程技术服务有限公司上海麦莎生物科技有限公司美国应用生物系统公司2720PCR扩增仪（ABI公司）紫外成像仪及电泳槽（Bio-Rad）7900全自动高通量荧光PCR检测仪（ABI公司）EDTA抗凝管美科美（北京）生物医学科技MegaBAC1000测序仪Pharmacia公司1.2 研究对象 经医院伦理委员会批准和患者及其家属知情同意并签署知情同意书后，将211例脓毒症患者纳入本纳入本研究中。脓毒症诊断严格按照1992年和2001年美国胸科医师协会及危重病学会制定的脓毒症诊断标准[12,13]。重症脓毒症定义为至少伴有一个急性脏器功能不全的脓毒症。急性脏器功能不全序贯性脏器衰竭评分（Sequential Organ Failure AssessmentSOFA）[14]大于等于2分。重症脓毒症患者的预后以28天生存率为准。存在下列情况的患者不被纳入本研究中：患有获得性免疫缺陷综合征；患者在前8周内接受过化疗；患者在器官移植术后接受过免疫抑制剂治疗；患者在前4周内使用过糖皮质激素。侵袭性真菌感染包括真菌血症和其他部位的侵袭性真菌感染。真菌血症患者血培养得到真菌生长结果，且有真菌血行感染相应的症状和体征其他部位的真菌感染：包括Ⅰ)组织穿刺、活检后，经组织病理学确