原儿茶酸对小鼠黑素瘤B16细胞酪氨酸酶活力及黑色素生成的抑制效应.doc

原儿茶酸对小鼠黑素瘤B16细胞酪氨酸酶活力及黑素生成的抑制效应 1，石艳1，李智聪2，王秋红2，陈清西1* (1厦门大学生命科学学院，滨海湿地生态系统教育部重点实验室，福建 厦门 361005， 2厦门特宝生物工程股份有限公司，福建，厦门 361022 ) 摘要：本研究影响实验结果：可显著降低细胞的黑素含量，10 μmol/L时使黑素含量降低60%原儿茶酸酪氨酸酶均有较强的抑制作用半抑制浓度为10 μmol/L, 对共培养体系中酪氨酸酶活力浓度和作用时间10 μmol/L作用54h可使酪氨酸酶活力下降88%．本研究为酪氨酸酶抑制剂奠定了基础 关键词：B16细胞；酪氨酸酶； 中图分类号：Q 356．1 文献标识码：A 酪氨酸酶(EC 114．18．1，Tyrosinase)是一种结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶，是生物体内黑色素合成的关键酶限速酶[1]．酪氨酸酶抑制剂在化妆品、果蔬保鲜、生物农药黑素代谢疾病等治疗方面，有巨大的应用前景[2-5]．原儿茶酸(34-二羟基苯甲酸)是许多中成药的有效成分之一，具有抗炎、神经保护、抗病毒、促进干细胞增殖分化等多种功效[6-9]原儿茶酸清除DPPH自由基能力、抑制过氧化氢自由基、清除含氮NO自由基的能力．在结构特点上作为一种酚类的物质，这提示它可能是潜在的酪氨酸酶抑制剂 与蘑菇酪氨酸酶相比B16细胞更能真实反应哺乳动物体内的酶活力变化规律系统地研究原儿茶酸对黑素生成和对酪氨酸酶的影响，为开发安全高效的酪氨酸酶抑制剂提供依据 基金项目国家，福建省科技项目2010N5013， *通讯作者：陈清西chenqx@xmu．edu．cn1 材料与方法 1材料本论文研究使用的小鼠黑色素瘤B16细胞购自上海生物化学与细胞所由本实验室液氮冻存、培养和传代L-多巴L-DOPA)购自Sigma 公司；RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清、细胞消化液购自GIBCO公司；Triton X-100购自Amresco公司；其它试剂为国产分析纯． 1Brandford法测定蛋白 参考文献[10]，并略加修改反应总体积至600μL待测样品加入量约6 μL其它反应组分按比例调整使用酶标仪测定595 nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，线性回归，制做标准曲线，计算待测样品中的蛋白含量 1.3 原儿茶酸对B16细胞黑色素生成的抑制效应 方法参考文献[1]，进行适当调整采用75 mL细胞培养瓶，细胞接种量约1-2×106/mL，于37 ℃5% CO2浓度下培养过夜更换含不同浓度原儿茶酸(1．25，2．5，5和10 μmol/L)的培养基后继续培养48 h，消化细胞，用01% Ttriton-X 100，100 mmol/L PBS缓冲液pH7．4)的混合液重悬细胞并计数，调整细胞浓度为7-10×106/mL加入氢氧化钠至终浓度为1 mol/L，80 ℃裂解2 h，裂解液于1000010 min，上清用Brandford法测定蛋白质浓度并测定405 nm吸光度计算单位蛋白质中黑色素的含量OD405/蛋白浓度，与空白对照细胞的黑色素含量比较，得到相对黑色素含量(%) 1.4 B16细胞酶的 接种小鼠B16细胞约×105-3×105至10 mL RPMI 1640完全培养基(含有10%血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL)中，培养24-48小时后至80%左右的细胞呈融合状态消化收集细胞，用02 mol/L PBS (pH 6．8) 缓冲液重悬细胞并计数，PBS缓冲液调整细胞浓度使细胞浓度在2-7×106/mL取300 μL细胞悬液于离心管内迅速置液氮中速冻2 min，取出再置37 ℃水浴中不断振摇使其快速解冻，解冻完全再立即置液氮中速冻，37 ℃水浴解冻同法操作共重复速冻-解冻5个循环15000 rpm/min低温离心15 min收取合并上清即得 1.5 B16细胞粗酶液活力测定 参考文献方法[1]，进行适当修改以1 mg/mL L-DOPA(L-多巴)水溶液为底物进行测定酶和底物均先预热至37 ℃，在酶标板中加入50 μL底物，再加入50 μL酶提取物，每个样品双复孔测定将各反应组分混匀后迅速置酶标仪内475 nm吸光值，每30读数1次，37 ℃动态测定30 min内OD值变化率，摩尔消光系数按3700mol/L·cm)-1计算酶活力．μmol产物的酶量． 1.6 细胞粗酶液比活力测定 根据细胞粗酶液的酶活力和总蛋白含量，计算出每mg总蛋白中酶的活力即为细胞粗酶液的比活力 1.7原儿茶酸对细胞粗酶活力的抑制效应 采用粗提的酶液进行测定该方法由本实验室建立并经过验证