课题3.血红蛋白的提取和分离.pptVIP

(三)纯化－－凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 3.样品的加入和洗脱 3.样品的加入和洗脱 2.凝胶色谱制作 1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。 2）凝胶色谱柱填料的处理 （1）凝胶的选择： （ ）（G-75） “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水7.5克。 （2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（ ）中充分溶胀后，配成（ ）。 蒸馏水 凝胶悬浮液 交联葡聚糖凝胶 ①固定：将色谱柱处置固定在支架上 ②装填：将（ ）一次性的缓慢倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 （3）凝胶色谱柱的装填方法 凝胶悬浮液 色谱柱 ③洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（ ）12小时。 洗涤平衡 50cm 3）样品加入与洗脱 ①加样前 打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口 缓冲液 凝胶面 ②加透析样品 注意正确的加样操作： ①不要触及破坏凝胶面 ②贴壁加样 ③使吸管管口沿管壁环绕移动 ①调整缓冲液面：与凝胶面平齐 ②滴加透析样品：用（ ）将1ml（ ）的样品加到色谱柱的（ ） ③样品渗入凝胶床：（ ） ④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 ⑤收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集 吸管 透析液 顶端 样品完全进凝胶层 5ml 红色的蛋白质 开始进行层析 收集得到的纯化后的蛋白 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 思考 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ）。 思考 样品的粗分离 纯化 纯度鉴定 （四）纯度鉴定：凝胶电泳 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 三 实验结果分析与评价 注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。 此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。 如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。 如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 注意事项 1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2. 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 3. 色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。 1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质