第四章猪的常见寄生虫病.ppt

预杂交的目的是用非特异性DNA分子(鲑精DNA或小牛胸腺DNA)及其他高分子化合物(Denhart’s溶液)将待测核酸分子中的非特异性位点封闭，以避免这些位点与探针的非特异性结合。 杂交反应是使单链核酸探针与固定在膜上的待测核酸单链在一定温度和条件下进行复性反应的过程。 杂交反应结束后，应进行 洗膜处理以洗去非特异性 杂交以及未杂交的标记探针，以避免干扰特异性杂 交信号的检测。膜洗净后，将继续进行杂交信号的检 测 第三步为杂交信号的检测。当探针是放射性标记时，杂交信号的检测通过放射自显影进行。即利用放射线在X光片上的成影作用来检测杂交信号。 操作时，在暗室内将滤膜与增感屏、X光片依序放置暗盒中，再将暗盒置—70℃曝光适当时间，取出X光片，进行显影和定影处理。 * 第三节 分子生物学诊断技术 一、DNA探针(DNA probe) 技术 1.基本原理 DNA探针是带有标记物的 已知序列的DNA片段。DNA探针技术的基本原理是碱基 配对。在变性而成为单链的 被检DNA中加入变性的探针，随着温度的降低，探针便可 与被检DNA中的互补序列形 成双链，这一过程称杂交。 通过捕捉探针标记物释放出 的信号，便可知被检DNA中有无与探针序列相同的DNA每一种病原体都具有独特的DNA片段，通过分离和标记这些片段，就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究 。 2.DNA探针的种类 按DNA探针的来源可分为 cDNA探针和基因组DNA 探针和动基体DNA(kDNA) 三大类 cDNA 探针 是将病原的mRNA反转录为DNA后获得的。其检测 的对象往往是在生命活动 中可以被激活并进行表达 的基因DNA 基因组DNA探针 来源于基因组。在寄生虫上常用基因组重复序列作为探针。这些重组序列在基因中高度重复，拷贝数很多，便于检出。但这些重复序列并不一定表达 kDNA探针 是较特殊的一类。在动 基体目原生动物中存在动 基体，内含大量环状DNA，分大环和小环两种。其中 小环拷贝数占绝对多数。 故往往以克隆的小环或小 环片段做为探针 近年来，人们往往根据已知的序列，人工合成寡聚DNA片段做为DNA探针 3.DNA探针的标记物及标记 用于DNA探针标记的有效 射性同位素和非放射性标 记物 常用的放射性同位素有 32P、35S、14C、125I 等 非放射性标记法可将生物 素、地高辛连接在dNTP 上，然后象放射性标记一 样掺入到核酸链中制备标 记探针 4.DNA杂交 杂交技术有固相杂交和液相 杂交之分。固相杂交技术目 前较为常用，先将待测核酸 结合到一定的固相支持物上， 再与液相中的标记探针进行 杂交。固相支持物常用硝酸 纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或尼 龙膜(nylon membrane) 固相杂交包括膜上印迹杂 交和原位杂交。前者包括 三个基本过程：第一，通 过印迹技术将核酸片段转 移到固相支持物上；第二， 用标记探针与支持物上的 核酸片段进行杂交；第三， 杂交信号的检测 用探针对细胞或组织 切片中的核酸杂交并 进行检测的方法称之 为核酸原位杂交。 其特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内，以确定有无该病原体的感染。 原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义 杂交的第一步是将DNA 或RNA转移到膜上 斑点印迹(dot—blot) 将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样后的膜进行80℃真空烘烤2h 应用斑点印迹技术，可在一张膜上同时进行多个样品的检测，操作简便、快速，在临床诊断中应用较广，适合进行特定基因的定性及定量研究，但不能鉴定所测基因的分子量 Southern印迹(southern blot) 是指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程 常规处理如下，先用限制性内切酶对DNA样品进行酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离，接着对凝胶进行变性处理，使双链DNA解离成单链，并将其转移到NC膜或其它固相支持物上，转移后各DNA片段的相对位置保持不变。 Southern印迹的方法有3种，分别为毛细管转移(或虹吸印迹)，电转移 和真空印迹，详细操作可参