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暑期實驗室經驗分享 中研院動物所吳金洌老師實驗室 生科04 891608彭柏欣 實驗室研究方向介紹 1.魚類感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的研究 2.選殖出吳郭魚之類胰島素生長因子 (IGF-I及IGF-II) 與生長激素三種基因之cDNA序列，基因體結構之分析，並利用E. coli表現出吳郭魚之IGF-I，IGF-II與GH的基因重組胜。選殖出斑馬魚與黑鯛IGF-I cDNA序列與斑馬魚基因體結構之分析並在酵母菌中表現黑鯛IGF-I的基因重組胜。 3.研究鯉魚適應環境溫度的調節機制 關於指導我的學長—何國牟學長 1.做出四色螢光魚 2.利用螢光魚研究慢性肝炎 3.圖片權屬於學長，在此不附上，敬請見諒。 我的實驗--毒性實驗 目的：想觀察不同化學物質對斑馬魚胚胎早期肝臟發育的影響，實驗先使用野生型斑馬魚，分別以不同濃度之化學藥品處理其授精48小時胚胎，以期可以測出對斑馬魚胚胎造成一定傷害，但不會立即致死的特定濃度，再使用綠色螢光蛋白質特定表現魚肝臟之基因轉殖斑馬魚，藉由其肝臟有綠色螢光標示，便於觀察其確實有無對肝臟造成損害，希望可以觀察到特定藥物對斑馬魚產生急性肝損傷的情況。 使用藥品 前後共計曾使用過DMSO、Alcohol、CCl4、carbamethapine、indomethacin(美洒辛) 、arsenic(砷) acid六種化學藥品，處理斑馬魚胚胎。 分別以加入不同濃度藥品的曝氣水，飼養於塑膠六格盤。 這六種藥物都被懷疑有輕重不一的肝毒性。 DMSO、Alcohol 使用最高濃度4%，雖部分魚體外觀有畸形現象，但並未產生可能為肝損傷導致的明顯表徵，例如：水腫、疑似肝部位出血，故未進行到使用轉基因魚實驗部分。 CCl4 使用濃度：3λ(0.03%)、4λ(0.04%) 。 對象：授精48小時斑馬魚胚胎。 觀察：在持續藥物處理都出現嚴重的水腫，及程度不一的內出血現象，但此損害現象非直接和化學藥品濃度成正比，在2λ處理組中，中毒現象並不明顯，且緩慢許多，在濃度2λ以下處理相同時間甚至看不出任何損傷。 懷疑一定濃度下CCl4可能腐蝕六格盤，溶解出未知有害物質，在進一步使用轉基因魚實驗中，改用玻璃培養皿操作，一組為轉基因魚，使用3.5λCCl4處理，另一組為野生型，使用4λCCl4處理。 CCl4 4λCCl4組明顯水腫及死亡的進展速度較3.5λ組快，相較於之前以六格盤同濃度組比較，中毒表徵及死亡速度進展較不嚴重且較緩慢，故先前考慮之CCl4腐蝕六格盤並溶解出未知有害物質，確有影響本實驗結果。 在以3.5λCCl4處理轉基因魚2天後，挑出肝臟有發光之幼魚，原先以一般光學顯微鏡觀察有疑似中毒表徵（如水腫、軀體發育畸形）的個體，經挑選後全部皆為不發螢光，剩下肝部有發螢光的個體，肝臟未出現明顯損傷且外觀正常。 CCl4 處理9天後以螢光顯微鏡觀察，肝部仍未出現明顯損傷，雖然其外觀已不健康有些水腫、出血，活動力不佳，多平躺狀態，且死亡過半；可能因為未達CCl4造成急性肝損傷濃度，或因處理時間不夠長，而魚已經體弱無法順利進食，飢餓而死。 後經林立元老師提醒，才知CCl4對部分塑膠 (PC)有腐蝕性。 Carbamethapine、Indomethacin、Arsenic acid 使用濃度：0.25λ(25μM)、0.125λ(12.5μM)、0.0625λ(6.25μM)各兩盤。 對象：授精48小時野生型斑馬魚胚胎。 觀察：其中indomethacin表態不正常及死亡情況最為嚴重，其次為arsenic acid 、carbamethapine，以一般光學顯微鏡觀察可見其肝臟部位較未處理的魚不透明，有些腫大，推測可能對肝臟造成傷害，故改使用轉基因魚。 Carbamethapine、Indomethacin、Arsenic acid 使用濃度：0.25λ的carbamethapine、indomethacin、arsenic acid。 對象：轉基因螢光斑馬魚48pfd 觀察：經過加藥處理6天後，開始出現死亡，14天後，以螢光顯微鏡觀察尚存活的小魚，其肝臟部分仍正常發光，無明顯的損傷。本次毒性實驗螢光部分缺少持續拍照，及對照組的比較，紀錄不夠完整、持續，我想這是這次毒性實驗對肝損傷無明顯發現的因素之一，是往後操作實驗我應注意的地方。 檢討 本次毒性實驗螢光部分缺少持續拍照，及對照組的比較，紀錄不夠完整、持續，我想這是這次毒性實驗對肝損傷無明顯發現的因素之一，是往後操作實驗我應注意的地方。 實驗中斷 進入雜工生活?意外的收穫 做些簡單的分生實驗，enzyme digestion ﹑ ligation ﹑ 藍白挑 ﹑mini-preparation等。 養魚度日 餵魚 產卵 換水 篩選