水杨酸对细菌、真菌和土豆酪氨酸酶的抑制作用研究.docVIP

水杨酸的抑酶与抑菌作用 郑国兴，张春乐，黄浩，张丽娟，林敏，陈清西* （教育部细胞生物学与肿瘤细胞工程重点实验室，厦门大学生命科学学院，福建 厦门 361005） 摘要：以水杨酸为效应物，研究其酶学效应和微生物效应．实验结果表明：水杨酸对马铃薯多酚氧化酶有明显的抑制作用，半抑制率（IC50）为2.05 mmol/L，抑制作用表现为非竞争性的可逆过程，其抑制常数为2.00 mmol/L．水杨酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌三种细菌和白色假丝酵母、黑曲霉两种真菌均有明显的抑制作用，其最小抑菌浓度（MIC）分别为0.75、0.5、0.5、0.25和0.75 mg/mL，最小杀菌浓度（MBC）分别为0.75、1.0、0.5、0.25和0.75 mg/mL．本研究为水杨酸在果蔬保鲜中的应用提供实验理论依据． 关键词：水杨酸；马铃薯多酚氧化酶；细菌；真菌；抑制作用 中图分类号：Q 356．1 文献标识码：A 我国果蔬、蔬菜资源丰富，产量均居世界第一位．然而，因采后处理技术落后，我国果蔬腐烂损失也高居全球榜首，每年因贮藏、运输当中变质的果蔬占总产量的1/7，造成巨大的经济损失．导致果蔬腐烂变质主要有微生物感染和酶促褐变两种[1~3]．其中，引起果蔬腐败的微生物主要有细菌、杆…… 1 材料与方法 1.1 材 料 水杨酸、KCrO4、庆大霉素均为国产分析纯试剂[1~3]．马铃薯多酚氧化酶由本实验室制备．L-3,4-二羟基苯氨酸（L-DOPA）为Aldrich化学公司产品．大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色假丝酵母、黑曲霉均由厦门大学生命科学学院微生物教研室提供…… 方 法 （1）PPO活力测定 参考文献[4]方法，在50 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 6.8）中，以0.5 mmol/L L-DOPA为底物，30℃下测定波长为475 nm的光密度值（OD475）随时间的增长直线，从斜率计算酶的活力，产物的消光系数按3700 L/(mol(cm)计算[5]．…… （2）微生物实验 抑菌实验：采用琼脂渗透法，在已经培养好的斜面培养物中分别加无菌生理盐水5 mL，用接种环刮下菌苔制成菌悬液，分别取菌悬液1 mL加到已融化又冷却至适当温度的100 mL…… 收稿日期：2005-12-22 基金项目：福建省科技攻关课题（2004N002）和国家自然科学基金资助 作者简介：郑国兴 (1978 ~ )，男，硕士研究生． *通讯作者：chenqx@jingxian.xmu.edu.cn 2 实验结果 2.1 水杨酸对马铃薯PPO抑制效应 研究水杨酸对马铃薯PPO抑制作用类型，在测活体系中，固定酶的浓度，改变底物L-DOPA浓度，测定不同浓度抑制剂对酶的活力的影响．由Lineweaver-Burk双倒数作图得到一组横轴截距不变的直线，说明这一组抑制剂不影响米氏常数(Km)，只影响最大反应速度(Vm)，其抑制机理表现为非竞争性类型，以不同浓度抑制剂下测定的1/Vm对抑制剂浓度作图(图1内插图)为一条直线，从直线的斜率可以求得抑制常数(KI=KIS)为2.00 mmol/L． 表1. 琼脂渗透法测定结果 Tab.1 The assay result of the agar diffusion method 效应物 浓度 E. coli B. subtilis St. aureus C. albicans A. niger DMSO ≥99.0％ ? ? ? ? ? 庆大霉素 80 U/mL 22 20(±) 25 ? ? KCrO4 1 mg/mL ? ? ? 14(±) 16(±) 水杨酸 40 18 15 22 12 12 注：“±”表示抑菌圈模糊，“?”表示无抑菌圈． 3 讨 论 …… 本文研究结果表明，水杨酸对于马铃薯PPO具有明显的抑制作用，它对该酶的活力表现为可逆非竞争性抑制作用．这说明抑制剂与酶分子的结合及底物分子与酶的结合是相互独立的，抑制剂不改变酶对底物的亲和力；抑制剂可以同时与游离酶(E)和结合酶(ES)结合，且结合常数相同．这也说明了水杨酸在酶分子上的结合位点并不在活性中心，而是活性中心以外的区域．因此，水杨酸作为马铃薯PPO的强效抑制剂，可望成为除抑菌功效外，同时能够防止果蔬产生酶促褐变的保鲜剂． 参考文献： 王成云．葱头腐烂的原因及防治对策[J]．北方园艺，2002，34（4）：68－69． Alvarez A M．Postharvest Diseases of Papaya[C] ．New York, Sp