实验2醋酸膜电泳分离血清蛋白.doc

实验2 醋酸膜电泳分离血清蛋白 一、目的 1、掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作 2、学会用醋酸纤维薄膜电泳分离血清中各种蛋白质组分 3、定量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量 二、原理 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白质电泳有简便、快速，样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白质，脂蛋白，血红蛋白，糖蛋白和同功酶的分离及用于免疫电泳中。 蛋白质是两性电解质，在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。这种现象称为蛋白质电泳。利用这一原理可以把各种蛋白质分离和定量。 本实验把血清放在pH8.6缓冲溶液湿透的醋酸纤维膜上进行电泳，血清蛋白在pH环境中以不同速度向正极移动、结果，血清蛋白在膜条上分为前后几条平行带， 白蛋白跑得快，以后顺序为, , β,γ—球蛋白。经固定染色后，呈现蛋白色带。 定量测定时，把膜条上各区带剪下，浸于稀碱溶液中，进行比色测定；便可求出各蛋白质的百分数。 三、材料、试剂与器具 （一）材料 1、新鲜血清一无溶血现象。（稀释5倍）。 2、醋酸纤维素薄膜——2×8厘米（浙江黄岩曙光化工厂生产） （二）试剂 1、巴比妥一巴比妥钠缓冲液（0.07M，pH8.6）：称取巴比妥1.66克和巴比妥钠12.76克，溶于少量蒸馏水后定溶到1000毫升。 2、染色液：称取氨基黑10B O.5克，加入蒸馏水40毫升，甲醇50毫升和冰醋酸10毫升，混匀，放于具塞的试剂瓶保存（可重复使用）。 3、漂洗液：取95%乙醇45毫升，冰醋5毫升和蒸馏水50毫升，混匀，在具塞的试剂内保存。 （三）器具 1、培养皿（直径9—10厘米） 2、直尺、铅笔、竹镊、2/3的盖玻片 3、电泳仪和电泳槽 普通滤纸 四、操作步骤 （一）仪器和薄膜的准备 1、醋酸纤维薄膜的湿润和选择：将薄膜小心地放入盛有缓冲液的培养皿 中，使它漂浮在液面。若迅速湿润，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若湿润时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等，则为厚薄不均匀的薄膜，实验中应选择质地均匀的薄膜。因为薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如薄膜不均匀可以造成区带歪扭不齐，各区带界线不清，背景脱色困难，实验结果难于重复等现象。 将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辩出光泽面和无光泽面，并在角上用铅笔标上记号。 2、制作“滤纸桥”：剪裁尺寸合适的滤纸条。取双层滤纸附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部湿润并驱除气泡，使滤纸紧贴支架上，即为滤纸桥（它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲溶液之间的“桥梁”）。 （二）点样 在薄膜无光泽的一面点样，点样区距负极端1.5厘米处。点样时，用2/3宽的盖坡片的轻轻的沾一层血清印在点样区，使形成具有一定宽度，粗细匀称的直线。 8cm 2cm 1.5cm 点样区 图2-1 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置 （三）、电泳 将已点样的薄膜使光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，膜条上点样的一端靠近负极，盖严电泳室。平衡10分钟，然后通电，调节电压至130伏，10分钟后和再调至160伏，电流强度为0.4~0.6毫安/厘米宽。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高或偏低，待电泳带展开约3.5厘米时关闭电源，一般通电时间为40—50分钟。 图2-2 醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图 （四）染色 电泳完毕取出膜条，直接浸入染色液中，染色5—10分钟。然后用漂洗液浸洗，每隔10分钟换一次漂洗液，直至蛋白区带底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。 图 2-3 醋酸纤维薄膜血清蛋白电泳图谱 从左至右，依次为：血清清蛋白、a1球蛋白、a2球蛋白，β球蛋白、γ球蛋白。 定量测定时可将膜条用滤纸平压吸干，按区带分段剪开，分别浸于0.4N氢氧化钠溶液中，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，进行比色(590m)。或者将干燥的电泳图谱膜条放透明液中浸泡2—3分钟后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。 五、注意事项 1、选择质地均匀的薄膜 2、点样量要适中，不能太多，也不能太少，而且要成粗细均匀的直线，否则影响电泳的结果。 3、电泳过程中注意监看电压，电流的情况。 六、实验报告 附血清蛋白电泳图谱，标明电极，从正极开始