脲酶的凝胶过滤分离纯化.ppt

凝胶层析原理 固定相：凝胶 （不带电荷，多孔网状，分子筛） 混合物随流动相流经固定相的层析柱时，依分子大小而分离 混合物样品随洗脱液运动： 一是随洗脱液垂直向下移动 二是作不定向扩散运动 实验原理 脲酶分子量(490kD)较大，脲酶粗制品通过交联葡聚糖Sephadex G-150层析柱 酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。 用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。 定时或定量收集洗脱液，绘制酶活性(洗脱)曲线 (NH2)2CO + H2O 2NH3 + CO2 实验具体流程 1.层析柱的制备 交联葡聚糖Sephadex G-150 1g 水 60ml 加热溶胀：沸水浴中加热5h，取出后冷却 至室温装柱 室温溶胀：需放置48~72h 6.洗脱与收集 在样品上加蒸馏水进行洗脱，流出的液 体分别收集到小离心管中 流速：4- 6s/滴（10-15滴/min）， 收集量：3ml/管(刻度离心管) 数量：共收集约8管(编号1, 2, 3…)