木材学实验指导书-福建农林大学.doc

仪器分析实验指导书 适用专业： 化学工程与工艺专业 学 时： 10 福建农林大学材料工程学院 化学工程与工艺实验室 2011年8月30日 实验一 饮料中咖啡因的分析（6学时） 一、目的要求： 通过对咖啡因样品紫外吸收光谱的测定，使学生学习并掌握紫外可见分光光度计的使用方法，并能够根据测绘的吸收谱图对相关的参数进行计算。了解高效液相色谱仪的基本结构，学习高效液相色谱仪的操作技术。通过用高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因，学习和掌握液相色谱法的基本原理和外标定量分析方法。 二、实验原理： 咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%，可乐饮料、APC药片等中均含咖啡因，其分子式为C8H10O2N4，结构式为: 吸收光谱——以不同波长的光依次通过一定浓度的被测物质，并分别测定每个波长的吸光度。以波长λ为横坐标，吸光度A 为纵坐标。所得到的曲线为吸收光谱。具有不饱和结构的有机物，在紫外区有特征吸收，所以紫外光谱是有机物鉴定的一种重要辅助手段。 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分(如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等)分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液也进入色谱系统。如流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间tR(或保留距离)和峰面积A后，可直接用tR定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工作曲线法(即外标法)测定饮料中的咖啡因含量。 三、实验仪器和材料： 1．仪器 紫外—可见分光光度计（自动扫描型）；带盖石英比色皿；HPLC1100型高效液相色谱仪，PDAD检测器；色谱柱：ODS(n—C18)柱；微量注射器注射器（50μL）；超声波发生器或水泵；容量瓶（5 mL，10 m，25 mL ，100mL）若干；移液管（2mL，5mL，10mL，15 mL）；漏斗；烧杯；0.45 μm混纤微孔过滤膜（或针孔过滤器）；回流冷凝装置；电炉（或电热套）；电子天平。 2．试剂 咖啡因标准品（纯度98%以上mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.01mg/mL的标准咖啡因储备液。将它装入带盖的石英吸收池中，以流动相为参比，在220～360nm标准系列mg/mL（按步骤1重新配制）的标准咖啡因储备液各0.00 mL、2.00 mL、5.00 mL、10.00 mL、15.00 mL至5只100 mL容量瓶中。用蒸馏水配制成咖啡因浓度分别为0，20，50，100，150μg/mL的标准系列。可乐型饮料将约25mL置于一100mL洁净干燥的烧杯中剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min以赶尽可乐中二氧化碳。取脱气试样10.0mL，通过混纤微孔滤膜过滤弃去最初的5mL，保留后5mL备用。mL90℃蒸馏水溶解。冷却后全部转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。取试样10.0mL，通过混纤微孔滤膜过滤弃去最初的5mL，保留后5mL备用。取试样10.0mL，通过混纤微孔滤膜过滤弃去最初的5mL，保留后5mL备用流动相：流动相的流速：1.mL/min； 柱温：40℃；ST = 9 min, PT = 2 min ; 检测波长进样：5μL的待测饮料试液。标准曲线的绘制　　峰面积，作峰面积－咖啡因浓度的标准曲线。样品测定从试样中吸取可乐、咖啡或茶叶进样，于测峰面积，然后根据标准曲线得出样品的峰面积相当于咖啡因的浓度c (μg/mL)。λmax和对应的吸光度Amax，计算峰值波长处的摩尔吸光系数εmax。 表1 咖啡因标准品的紫外吸收光谱测定记录表 测定条件 标样浓度（mg/mL） 最大吸收波长λmax（nm） 吸光度Amax 摩尔吸光系数εmax（L/mol·cm） 测定每一个标准样的保留时间。图上进样信号与色谱峰极大值之间的距离。 根据标准试样色谱图中的保留数据，找到并标出试样色谱图中对应咖啡因的色谱峰。 记录每一张色谱图上的峰面积，并对每一个样品求出平均值。 用标准试样的数据作峰面积A对质量浓度ρ(mg／mL)的工作曲线。 从工作曲线上求得试样中咖啡因的质量浓度(mg／mL)。 表2 咖啡因标准品和饮料试液的HPLC测定记录表 序号 标样浓度ρ（μg·mL (1） 保留时间tR(min) 进样次数 峰面积平均值 AS(mm2) 1 2 3 峰面积AS(mm2) 峰面积AS(mm2) 峰面积AS(mm2) 峰面积AS(mm2) 1 0 2 20 3 50 4 10