降解多菌灵木霉Tr1原生质体制备及再生条件研究.docVIP

降解多菌灵木霉Tr1原生质体制备及再生条件研究 　　摘要：研究可降解多菌灵的木霉菌株Tr1的原生质体制备及再生的适宜条件，发现该菌原生质体制备的最佳条件为菌龄20 h，裂解酶液为5 mg/mL的溶菌酶和蜗牛酶的混合酶液，二者使用前按照体积比2∶1混合，酶解温度30 ℃，50 r/min缓慢振荡酶解2.5 h，渗透压稳定剂为0.7 mol/L KCl，原生质体产量达6.44×106个/mL。原生质体再生的优化条件为：PDA为培养基，添加0.3 mol/L KCl和0.3 mol/L环己六醇作为渗透压稳定剂，采用双层固体培养方式，有助于原生质体的再生。 　　关键词：多菌灵；木霉；原生质体；制备；再生 　　中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）10-2500-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.014 　　Abstract：The suitable preparation and regeneration conditions of protoplast preparation of Trichoderma sp. Tr1 was studied. The results showed the optimum condition for preparation of protoplast of strain Tr1：The culture time of mycelium was 20 h， the protoplast lysate was a mixed solution of 5 mg/mL lysozyme and 5 mg/mL snail enzyme and they would be mixed according to the volume ratio of 2∶1 before using， it was mildly shaked with a speed of 50 r/min under 30 ℃ for 2.5 h， 0.7 mol/L KCl was used as osmotic stabilizer. Under this condition， the yield of protoplast could be 6.44×106/mL. The optimum condition for regeneration of protoplast was PDA as the basic culture medium，0.3 mol/L KCl and 0.3 mol/L inositol as the osmotic stabilizer， and double-layer solid culture was helpful for protoplast regeneration of Trichoderma sp. Tr1. 　　Key words： carbendazim； Trichderma sp.； protoplast； preparaton； regeneration 　　多菌灵（Carbendazim，MBC）是一种高效广谱的苯并咪唑类杀菌剂，其广泛使用给生态环境和人体健康造成了危害[1]。为解决多菌灵农残污染问题，人们开始研究多菌灵降解菌株，目前报道的降解菌株多为细菌，如红平红球菌、假单胞菌等[2，3]。虽然部分菌株对多菌灵的降解效率较高，但由于菌株本身对植物病原菌没有拮抗作用，功能单一且制剂保存期短，市场应用前景受到限制。 　　木霉菌是一类重要的植物病生防菌，研究和应用广泛[4]。但多数木霉菌株对多菌灵敏感，因此多菌灵在土壤中的残留影响了木霉的生防效果。筛选和选育降解多菌灵的生防木霉菌，将实现生防和降解农残功能的有机结合。2008年田连生等[5]首次报道一株木霉对多菌灵有一定的降解能力。前期试验筛选到一株可降解多菌灵的生防木霉，但降解效率低。应用原生质体融合技术是目前得到优良菌种的有效方法之一，原生质体没有细胞壁，对诱变剂反应灵敏，容易得到正突变株[6，7]。因此利用原生质体融合技术对哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和其他对多菌灵敏感的木霉生防菌株进行种间杂交，有望选育出对多菌灵高效降解的生防木霉菌株。本研究对可降解多菌灵的哈茨木霉Tr1原生质体的制备条件进行了研究，为新菌种的选育奠定了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 供试菌株 　　哈茨木霉Tr1为山东省应用微生物重点实验室分离获得，对多菌灵具有一定的降解作用，同时对部分植物病原真菌具有一定的抑菌效果。 　　1.2 培养基 　　PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20