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降解烟碱细菌K9发酵培养基优化研究 　　摘要 通过单因素实验法筛选出K9菌株培养基中的最佳碳源、有机氮源、无机氮源和关键无机盐因子，然后用正交试验确定无机盐的最佳含量，最后用旋转中心组合设计及响应面分析法确定培养基中可溶性淀粉、蛋白胨及硝酸铵的最佳浓度，实现培养基的优化。利用Design Expert软件进行分析，得到各因素的最佳水平值为可溶性淀粉35.0 g/L、蛋白胨5.14 g/L、硝酸铵3.73 g/L，活菌数达到32.4×108 cfu/mL，比优化前提高了4.4倍。通过研究优化出的发酵培养基为今后降解烟碱菌剂的开发利用奠定了基础。 　　关键词 烟草节杆菌K9；发酵培养基；降解烟碱菌剂；响应面分析法 　　中图分类号 S572；S182 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）09-0289-03 　　据科学研究分析，烟草烟雾中含有的有毒有害成分高达数百种，包括烟碱、烟焦油、氧化碳、放射性物质等，同时烟草中还含有丙烯醛、氰化钾、甲醛、镍、汞、砷、氨、镉等对人体有致命危害的成分[1-2]。烟碱（尼古丁）是烟草中主要生物碱，卷烟中的尼古丁含量大约为1 mg/支。其具有神经毒性，烟碱对人的神经系统具有刺激作用，同时具有一定的麻痹作用，少量摄入烟碱会产生兴奋感，而大量摄入则会影响大脑皮质的神经活动，导致晕眩、呕吐等不良症状，使人的智力减退；烟碱会引起血管的痉挛症状，还会改变胃液的酸碱度；烟碱可刺激交感神经，引起血管内膜损害；并且因烟碱会增加血液黏度而使血管收缩，增加发生心脏病的几率，严重者甚至导致烟碱中毒死亡。研究表明，成年人摄入烟碱量为40～60 mg即可致死。若将1支雪茄烟或3支香烟所含有的尼古丁注入人的静脉内，3～5 min即可致死。因此，烟草制品中的烟碱含量对吸烟者的健康影响较大。与此同时，烟碱还具有令人可畏的成瘾性，包括生理成瘾性和心理成瘾性。生理成瘾性是指人体在吸入烟草烟雾后，其中的烟碱经过血液循环进入大脑，刺激脑部受体而释放出引起大脑兴奋的多巴胺，而随着刺激的增加，受体的敏感性降低，需要越来越多的烟碱的刺激才能产生兴奋，导致人体对烟草的依赖性增加。若停止吸烟，则血液中烟碱含量降低，导致兴奋度降低，生理快感降低，从而使人体产生一系列诸如头疼、焦虑、烦躁等不适症状，即产生戒断综合征，这也是戒烟难度较大的重要原因之一。 　　本文主要研究烟草节杆菌K9对于烟碱的降解培养基优化条件。烟草节杆菌K9[3]是降解烟碱的高效菌株，用NB培养基培养烟草节杆菌K9时，细胞浓度仅能达到7.4×108 cfu/mL左右，故为提高菌体浓度，对培养基进行相应优化，以获得高浓度的烟草节杆菌K9。研究以易于细菌生长的改良培养基为基础，利用单因素实验法对烟碱节杆菌的碳源、氮源和无机盐生长强化因子进行筛选，为研制烟草降碱菌剂奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验概况 　　本研究于2015年在安徽皖南烟叶有限责任公司技术中心实验室进行。供试菌株为烟草节杆菌K9，为云南省烟草农业科学院微生物实验室保存菌株。 　　1.2 试验设计与实施 　　先利用单因素实验方法筛选出K9的碳源、氮源和无机盐离子，再利用响应面法对其培养基进行优化，从而得出培养基最佳成分和浓度。然后进一步用响应面法中的旋转中心组合设计对其进行优化，以获得菌株生长的最佳培养浓度。 　　2 结果与分析 　　2.1 降碱菌K9在NB培养基中的生长曲线 　　以活菌数为衡量标准，每隔3 h取样1次，将样品稀释涂平板，培养48 h，检测活菌数，绘制降碱菌K9在NB培养基中的生长曲线（图1），可以看出降碱菌K9在NB培养基中连续培养48 h，在0～9 h为菌体的延滞期，菌体生长9 h之后进入对数生长期，菌体浓度迅速增长，42 h左右达到最高，为35×108 cfu/mL，48 h之后进入衰亡期。 　　2.2 降碱菌K9最适培养基的筛选 　　2.2.1 不同碳源、氮源对降碱菌生长的影响。不同碳源对降碱菌K9生长的影响结果见表1，可知最佳碳源为可溶性淀粉，菌浓度达到7.30×108 cfu/mL。不同氮源对降碱菌的影响结果见表2，可知最佳有机氮源为蛋白胨，菌浓度达到4.97×108 cfu/mL。最佳无机氮源为硝酸铵，菌浓度达到6.94×107 cfu/mL。而不添加氮源物质时降碱菌的生长情况最差，菌浓度仅为1.00×106 cfu/mL。因此，选定可溶性淀粉、蛋白胨和硝酸铵作为最佳的碳源、氮源进行响应面分析试验[1-4]。 　　2.2.2 不同无机盐离子对降碱菌生长的影响。 　　（1）无机盐单因子筛选。通过对无机盐培养基中的8种无机盐离子进行逐一筛选发现不同无机盐离子的有无对降碱菌生长的影响各不相同。从表3可知，当无机盐离子中无K2HPO