促红生长素(EPO)概要.ppt

在2008年北京奥运会中第一例的兴奋剂检查呈阳性的西班牙自行车选手玛丽亚·莫里诺，就是被发现使用使用促红细胞生成素(EPO)，国际奥委会于2008年8月11日宣布取消其参赛资格。 应用案例 EPO作为兴奋剂的使用 其它应用 ：促进新血管的形成和减少心肌 梗塞面积，控制细胞凋亡，进而保护以及组织免受缺氧、毒素及氧化应激系统诱导损伤。 ：抑制细胞表面炎症因子，降低正常细胞对炎症效应。 :作用于小肠内膜表面EPO受体，促粘膜增生发育，继而小肠对脂类 及氨基酸类物质吸收功能。 1、对心脏的作用 2、抑制炎症 3、抑制炎症 用量用法 　 静脉注射开始应用较低剂量50～100IU/kg，每周3次，如果在4周内，网状红细胞计数、血细胞比容和血红蛋白水平未见明显增加，本品的剂量可递增 不良反应及禁忌 常见有血压升高、心悸。偶见瘙痒感、皮疹及GOT或GPT值升高、恶心、呕吐、眩晕、头痛、发热、血钾升高等。 血液透析不能控制动脉血压升高的患者、铅中毒及感染患者禁用，有药物过敏者、变态反应体质者慎用。应及时对用本品治疗者的血压进行监测，必要时给抗高血压药物。应注意血管栓塞情况，有时需增加肝素的剂量。必要时补铁，使患者的转铁蛋白饱和度维持在20%以上 谷丙转氨酶 天 冬 氨 酸 转 氨 酶 1．肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程中，往往通过注射EPO来提高体内EPO水平进行治疗，从而帮助病人增加红细胞数量，此时EPO水平有所上升。 　　 2．其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者EPO水平不降低，但也可以使用EPO治疗，此时浓度也会有所升高 3. 生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者EPO水平升高。 临床意义 重组EPO 天然的 hEPO制品一般是从贫血病患者尿中提取的，所以药源极为匮乏，不能满足需要。因此，在20世纪80年代就开始rhEPO的研究，从胎儿肝中克隆出 人促红细胞生成素基因, 并研制成功 重组人EPO。 目前国内外在获取EPO基因后，首选中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达系统来表达生产重组人EPO。 重组人促红素注射液（CHO细胞） 【商品名】益比奥 【规格】1万国级单位/瓶 【生产厂家】沈阳三生制药 【成分】重组人促红素。辅料：人血白蛋白、氯化钠、一水枸橼酸、二水枸橼酸三钠 构建基因组噬菌体文库克隆EPO基因 血细胞 中提取基 因组DNA 筛选完整EPO 基因的插 入片段 转入CHO 中表达。 PCR方法 从基因组模板 中扩增EPO基 因片段为探针 BamHⅠ酶切 回收酶切片段 构建基因组 噬菌体文库 插入噬菌体 EMBL3载体 克隆 重组EPO的生物学活性检测 ?正常功能状况下，EPO的主要生物学性状是增加红细胞的产生，因此红细胞数目的增多，血红蛋白含量的增加及红细胞压积的改变，此三项指标可以用于反映EPO的体内生物学活性，这也是比较特异性的检测指标。 检验方法 可由SD大鼠来完成。其大致做法为：一周两次，连续3周对实验动物皮下注射rHuEPO；实验对照组则同等剂量的生理盐水，在实验结束时，检测实验组与对照组红细胞计数、血红蛋白含量及血球压积，以确定rHuEPO的体内生物学活性。 检验结果记录 组别 实验组 对照组 注射方式 检验类别 皮下注射rHuEPO 同等剂量的生理盐水 红细胞计数 血红蛋白含量 血球压积 EPO的血清检测 采用酶免检测试剂盒检测。 检测原理 采用双抗体夹心法检测EPO。两种不同的抗体，分别包被微孔板和标记HRP酶。当 标本中含有相应的抗原时，会形成抗体-抗原-抗体-酶的复合物。未结合的物质通过洗涤去除。加入显色底物显 色，通过测量颜色的变化来判断标本中抗原的浓度。 酶联反应 检验步骤 1 准备 (1).测试前将试剂盒组分置于室温(18- 25℃)平衡30分钟，测试后应立即放回2-8℃保存。 (2).如果EPO浓度高于160mU/ml，稀释后检测。 2、反应 (1).取出所需要的板条。 (2).分别向孔中加入50μl标准品、质控血清或标本。 (3).每孔中加入50μl酶结合物。震动10-20秒混匀。 (4).37℃孵育30分钟。 (5).扣除孔中液体，并用洗液洗涤5次。 (6).在干净的纸巾或毛巾上拍干，尽量去除残留的水分。? 3、显色 (1).每孔各加入1滴显色底物A和B，置于室温(18-25℃)避光显色15分钟。 (2).每孔加入1滴终止液，轻轻震动几次混匀。 (3).在30分钟内，以630nm作为参考波长，测量450