21三体综合征产前诊断.ppt

jieguo * 21三体综合征产前诊断 From 临床17班第三小组 案例 张某，女，31岁，商场收银员，怀孕16周，担心所孕胎儿不正常，前来进行遗传咨询。经询问得知，张某的一表姐曾生育一智力低下儿子，经某医院诊断为先天愚型，但具体核型不详。张某孕前检查各项优生指标均正常，孕前无感冒服药史，无有毒有害物质接触史。张某的丈夫，32岁，司机，有烟酒嗜好，在妻子怀孕前半年已戒酒，减少吸烟量。两人核型检查均正常，家族中其他特殊疾病患者。根据张某的情况，作中孕期唐氏筛查，结果张某血清的AFP ,hCG 和uE3检查结果阳性。根据上述资料和风险评估，张某所孕胎儿具有21三体综合症的高风险，建议进行产前诊断。 孕妇就诊 常规筛查 综合分析风险值 孕期检查 进一步确诊 羊膜穿刺 荧光原位杂交技术 PCR技术 结果分析 遗传建议 羊膜穿刺 离心 实验流程： 羊膜穿刺---羊水中有一定数量胎儿脱落细胞（多为成纤维细胞和上皮细胞）,经体外培养后,可进行染色体分析.酶和蛋白质检测性、染色体检查和提取DNA作基因分析，也可不经培养，用微量技术作酶和蛋白质分析或直接提取DNA作基因诊断。 时间：妊娠16~20周 步骤：（B超监视下进行）孕妇排空膀胱—腰穿针穿刺—穿过腹壁和子宫 壁进入羊膜腔—抽取羊水 荧光原位杂交（FISH） FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析. 材料 ??? 仪器? 离心机，水浴锅，恒温培养箱，荧光显微镜。 试剂 ? 荧光探针 。工作液的配制：（1）20×SSC：氯化钠175g，柠檬酸三钠 88.2g，加三蒸水到1000ml。（2）变性液：甲酰胺28ml，20×SSC 4ml，蒸馏水8ml，终体积40ml，充分混匀，调整pH至7.0～8.0,密封保 存于4℃～8℃,每次使用前均需测定pH值。（3）洗脱液：甲酰胺 20ml，20×SSC 4ml，蒸馏水16ml，终体积40ml。（4）SSCT： 20×SSC 100ml，Tween-20 0.2ml，加二蒸水至终体积为1000ml。 方法 1.羊水细胞涂片的制备 ? 抽取羊水5～6ml，1500rpm离心10min，去上清，留羊水细胞沉淀；在细胞沉淀中加3ml 0.25%trypsin（溶于无CaCl2的Hanks液），37℃消化30min；2000rpm离心10min，去上清，在沉淀中加入4～5ml 0.75mol/L KCl,37℃孵育30min，再加入1ml固定液（甲醇∶冰醋酸为3∶1），轻轻混匀，2000rpm离心10min，去上清，加5ml固定液，轻轻混匀，2000rpm离心10min，去上清，加适量固定液，滴片。 ?2. 杂交、洗脱、显色 ? (1)将pH为7.0～7.5的变性液(70%甲酰胺/2×SSC)放入水浴中预热至74℃,将一支干净的温度计插入变性液中以确认温度达到了74℃，注意冷玻片插入变性液中将降低变性液的温度。(2)将玻片插入预热的变性液中3～4min，不要摇动，然后迅速将玻片插入预冷至-20℃的酒精中，依次从70%、90%到100%酒精中各脱水2min。(3)将探针于37℃保温5min，轻轻振动后短暂离心收集液体于管底（不要变性探针）。(4)用刻字笔将标本周围划线，加上10μl探针。盖上盖玻片，在盖玻片周围封上一层rubber cement，将玻片置于湿盒中于37℃杂交过夜。 荧光原位杂交技术 (5)在水浴中预热40ml洗脱液（50%甲酰胺/2SSC）至43℃，将一支 干净的温度计插入洗脱液中证实温度达到43℃。 (6)用镊子小心地除去rubber cement，小心揭开盖玻片，将玻片插入 洗脱液中洗脱10min，然后再重复一次。洗脱液的温度对于信号强度与特异性非常关键，洗脱液温度不能低于43℃。以免由于交叉杂交导致背景产生。 (7)将玻片在37℃的2×SSC中洗脱2次，每次4min。 (8)将玻片置于室温SSCT液中洗脱2min。 （9）将玻片取出，用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT，不要让玻片干掉，以免由于检测试剂的非特异性结合导致高背景荧光。 （10）在每块玻片上加上30μl avidin-FITC，盖上盖玻片，37℃孵育20min。 （11）小心去除盖玻片，将玻片在室温SSCT中洗脱3次，每次2mi （12）用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT，加上30ml Anti-avidin于标本上，盖上盖玻片，37℃孵育20min。 （13）小心去除盖玻片，在室温的SSCT中洗脱3次，每次