资料-多糖含量定测的各种方法优缺点.docVIP

苯酚-硫酸法测多糖含量 一、原理 多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 二、试剂 　　1、浓硫酸：分析纯，95.5% 　　2、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 　　3、6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） 　　4、标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。 　　5、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 　　6、5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 　　7、6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 8、6mol/L 盐酸 三、操作 　　1、制作标准曲线 准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 　　2、样品含量测定 　　1）取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。 　　2）离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。 　　3）水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。 　　4）定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 四、注意 1、此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。 2、制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。 3、对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。 4、测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1~0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定，即可无碍。 蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量 ?一、实验原理? 糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮（C14H10O）脱水缩合，形成糠醛的衍生物呈蓝绿色。该物质在620nm处有最大吸收，在150μg/mL范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。该法有很高的灵敏度，糖含量在30μg左右就能进行测定。? 二、试剂器材? 1、蒽酮试剂：精密称取0.1g蒽酮，加80%浓H2SO4100mL使溶解，摇匀。当日配制使用；? 2、葡萄糖标准液：将无水葡萄糖置于五氧化二磷干燥器中，12hr后精密称取100mg，用蒸馏水定容至100ml；? 3、其他器材：分析天平、分光光度计、容量瓶（100ml、50ml、10ml）、烧杯、具塞试管、移液器、移液器吸头、涡旋振荡器和废液缸等。 ?三、?操作步骤? 1、葡萄糖标准曲线的制作? 取7支具塞试管，按下表数据精密配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液，每个浓度做2~3个重复： 管号 0 1 2 3 4 5 6 标准葡萄糖溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水/mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 在每支试管中立即加入蒽酮试剂6mL，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min。? 在625nm波长下以第1管为空白，迅速测定其余各管吸光值。? 以标准葡萄糖含量(?g)为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。? 2、样品的测定? 将样品溶液糖浓度调整到测定范围，精确吸取2mL置于干燥洁净试管中，在每支试管中立即加入蒽酮试剂6mL，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min，每个浓度做2~3个重复。? 在625nm波长下迅速测定各管吸光值。根据葡萄糖含量的标准曲线，由样品溶液吸光值计