水中退伍军人菌检测方法.doc

水中退伍軍人菌檢測方法 NIEA W238.50C 一、方法概要 　　水樣經濃縮及酸處理後，塗抹於活性碳酵母萃取物選擇性培養基（Buffered charcoal yeast extract agar with selective supplements, BCYE with selective supplements），在二氧化碳培養箱，36 ± 1℃，培養5 ± 2天，疑似退伍軍人菌（Legionella spp.）的菌落，應進行半胱氨酸需求試驗（L-cysteine requirement test）、革蘭氏染色（Gram stain）及直接螢光抗體染色試驗（Direct immunofluorescent antibody test，DFA）或乳膠凝集試驗（Latex agglutination test）確認。 　? 　凡生長於含半胱氨酸之活性碳酵母萃取物培養基（BCYE），但不生長於不含半胱氨酸之活性碳酵母萃取物培養基（BCYE without L-cysteine）之菌落，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌，無莢膜、不產孢子、短胖型或長絲型，及直接螢光抗體檢驗或乳膠凝集試驗呈陽性反應者，即判定為退伍軍人菌陽性菌落。 二、適用範圍 (一) 本方法適用飲用水水質、飲用水之水源水質及水塔冷卻水中退伍軍人菌之檢驗。 (二) 生物安全等級二級以上之實驗室才能進行本方法之檢測。 三、干擾 (一) 水樣中含有抑制或促進退伍軍人菌生長之物質（如水樣中含有消毒劑或營養源會抑制或促進生長）。 (二) 檢測使用的器皿及設備含有抑制或促進退伍軍人菌生長的物質（如器皿及設備含有清潔劑或營養源會抑制或促進生長）。 (三) 濁度過高之水樣易造成濾膜孔隙阻塞，將影響水樣的濃縮效率，進而影響檢測結果。 (四) 雜菌過多將遮蔽或抑制退伍軍人菌之生長。 四、設備與材料 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1 mL刻度之10 mL滅菌玻璃吸管或市售無菌塑膠吸管，或無菌微量吸管（micropipet）。 (三) 試管：大小約150 × 15 mm之試管或有蓋螺旋試管。 (四) 稀釋瓶：容量約100 mL可滅菌之硼矽玻璃製品。 (五) 錐形瓶：200至2000 mL之可滅菌硼矽玻璃製品。 (六) 採樣容器：容量500 mL以上無菌之硼矽玻璃瓶或無菌塑膠有蓋容器，或市售無菌袋。 (七) 冰箱：溫度能保持在4 ± 2℃者。 (八) 培養皿：可滅菌硼矽玻璃製或可拋棄式無菌塑膠製培養皿，大小為90～100 × 15 mm或其他適當大小。 (九) 過濾裝置：能耐高溫高壓滅菌的玻璃、塑膠、陶瓷或不鏽鋼等材質構成之無縫隙漏斗，以鎖定裝置、磁力或重力固定於底部。 (十) 抽氣幫浦：水壓式或吸氣式，壓力差最好在138至207 kPa者。 (十一) 濾膜：直徑47 mm，孔徑0.22 μm的無菌聚碳酸濾膜（polycarbonate membrane）。 (十二) 天平：待測物重量大於2 g時，須能精秤至0.01 g；待測物重量不大於2 g時，須能精秤至0.001 g。 (十三) 二氧化碳培養箱（CO2培養箱）：能提供2.5～5.0% CO2，溫度能保持在36 ± 1℃者。 (十四) 高壓滅菌釜：溫度能維持在 121℃（壓力約15 lb / in2或1.1 Kg / cm2）滅菌15分鐘以上者。 (十五) 高溫乾熱烘箱：如用於玻璃器皿等用具之滅菌，溫度須能保持在160℃達2小時或170℃達1小時以上者。 (十六) 加熱板：可調溫度，並附磁石攪拌功能。 (十七) 鑷子：前端平滑、內側無波紋，使用前浸泡於95%酒精再以火燄燃燒滅菌。 (十八) 接種環：為白金或鎳鉻合金製，適用於細菌接種或移植，亦可使用無菌塑膠製品。 (十九) 水浴槽：溫度能保持在約50℃者。 (二十) 第二級生物安全櫃（Class Ⅱ BSC）。 (二十一) pH計：pH計之精密度必須達到0.1 pH單位。用於內含瓊脂培養基之pH值測定時，應搭配表面電極（surface probe）。 (二十二) 解剖顯微鏡：能放大10～20倍。 (二十三) 光學顯微鏡：能放大至1000倍油鏡。 (二十四) 螢光顯微鏡：能放大至1000倍。 (二十五) 紫外光燈：波長365 nm。 (二十六) 試管震盪器（Vortex mixer）。 (二十七) 馬克法藍氏濁度標準計（McFarland nephelometer standard units）。 (二十八) 玻片及蓋玻片：光學染色及螢光染色專用兩種。 (二十九) 乳膠或PVC手套。 (三　十) 離心機：轉速可達3000 g，30分鐘以上，能控制溫度在4 ± 2℃者。