整个基因克隆实验流程.doc

组织总RNA的提取 取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。 逆转录 根据逆转录试剂盒（TOYOBO公司）说明书进行，反应体系及条件如下： 试剂 使用量（μl） Rnase Free H2O 11.75-Y Oligo（dT） 1 Total RNA（1000ng） Y Total Volume 12 65℃，5min后，立即置于冰上。 试剂 使用量（μl） 上一步变性后的RNA溶液 12 5×RT Buffer 4 dNTP Mixture（各10mM） 2 Rnase Inhibitor（10U/μl） 0.25 Rever Tra Ace 1 Total Volume 20 然后放置于PCR仪上， 反应程序为： 42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。所得cDNA放置于-20℃保存。 PCR反应 试剂 使用量（μl） ddH2O 6.0 反转录产物 1.0 10×PCR Buffer 1.0 dNTP（10mmol/l） 0.2 Taq酶（1U/μl） 0.4 Ghrelin-F（10μmol/l） 0.4 Ghrelin-R（10μmol/l） 0.4 MgCl2（25mmol/l） 0.6 Total Volume 10 反应条件：95℃,预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。 反应结束后，取5μl PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。 PCR产物的分离，回收和纯化 PCR反应得到目的条带后，加大反应体积，然后根据胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收纯化。将所得DNA贮存于-20℃。 目的片段与载体的连接 按照连接试剂盒(TAKARA公司)说明书进行操作。 pMD-18T载体 1μl DNA 2μl ddH2O 2μl 然后加入5μl Ligation Mix，4℃放置 过夜连接。 转化 CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞 全过程冰上进行，4℃离心，无菌操作。 （1）以接种环从-80℃保存的高效转化菌种蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12h； （2）挑取单菌落接种于1ml无抗生素LB培养基中，37℃剧烈震荡培养6h； （3）按1:100接种菌液于25ml LB液体培养基中，37℃震荡培养1.5～2h，至OD600达0.4～0.6；（这一步非常关键，培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA的能力较低，从而导致转化率降低） （4）冰上预冷10min；然后4℃，6000rpm离心10min； （6）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于25ml预冷的0.1M CaCl2中，冰浴20min； （7）4℃，6000rpm离心10min，弃尽上清； （8）以1.25ml（菌液体积的5%）预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入0.3ml预冷的100%甘油（甘油终浓度达15～20%），混匀后按每支100μl在冰上分装。-80℃保存备用。 连接产物转化到感受态