生物大分子分离纯化-原理与技术教材.ppt

层析的起源和原理 起源----1906年，俄国植物学家Tsweet 原理----利用物质分配系数不同达到分离 目的 凝胶过滤 凝胶结构 Steric exclusion leads to early elution Columns Media Bio-Scale Mini High Q Macro-Prep high Q Bio-Scale Mini High DEAE Macro-Prep DEAE Bio-Scale Mini High S Macro-Prep high S Bio-Scale Mini UNOsphere Q Macro-Prep CM Bio-Scale Mini UNOsphere S Macro-Prep 25 Q Bio-Scale Mini UNOsphere rapid S Macro-Prep 25 S UNO Q UNOsphere Q UNO S UNOsphere S UNOsphere rapid S 更高的选择性和分辨率 10% 穿透载量: Unosphere Q: 150 mg/ml BSA @ 600 cm/hr Unosphere S: 30 mg/ml BIgG @ 600 cm/hr 高流速，低反压 －操作压力: 2 bar @ 1200 cm/hr with 20 cm 更高的碱稳定性 短期 : 1.0 M NaOH @ RT for 1 week 长期 : Storage in 0.1 M NaOH @ RT for 1 year 生产效率大大提高 高流速，低反压：Unosphere 左边: Bio-Gel HT/HTP 羟基磷灰石 右边: CFT/CHTTM 陶瓷羟基磷灰石 III Ca10(PO4)6(OH)2 5 个带正电荷的Ca离子对（C位点） 2 个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点） 2 个羟基 于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面 初级保留机制 蛋白质带正电氨基 经典的阳离子交换 用中性盐溶液 (NaCl) 或缓冲盐溶液 (PO4)洗脱 初级保留机制 带负电羧基 经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节 比离子间静电相互作用强15–60倍 在无PO4 条件下不能被任何浓度NaCl洗脱 用PO4洗脱 混合保留机制 大部分大分子蛋白质以两种保留机制联合模式结合：Ca亲和与阳离子交换 酸性蛋白质的结合，如白蛋白（albumin）以钙亲和作用为主，阳离子交换仅有轻微的作用，这意味着NaCl对白蛋白载量和保留的影响是非常有限的。 碱性蛋白质，如IgG以阳离子交换作用为主，其载量和保留受NaCl影响显著 混合保留机制 Equlibrate: 5mM NaPO4 pH 6.5 Gradient: 5mM–300mM NaPO4 羟基磷灰石应用 单克隆抗体，多克隆抗体纯化 重组疫苗 抗体片段 重组蛋白质 酶 核酸:DNA/RNA (单双链) 膜蛋白质 优点 独特的分离机制 高再生能力 高分辨率 容易规模放大 容易进行方法开发 高机械稳定性 高化学稳定性 层析柱寿命长 易于将HT工艺直接转移到CHT/CFT上 CFT 比CHT更耐酸 如何选择类型 Critical contaminants in downstream process development Retention of aggregates Aggregates tend to bind CHT more strongly than “monomeric” IgG. This indicates that the binding characteristics of the individual IgG molecules in an aggregate are additive. The larger the aggregate, the stronger the binding. Aggregate removal in NaCl gradients at low concentrations of phosphate generally provides even better separation than size exclusion chromatograph