生物制药工艺学实验2教材.ppt

南京师范大学生命科学学院 张茵 2015年4月 实验二 柱层析法提取溶菌酶 实验目的 掌握静态和动态离子交换的方法； 掌握从生物材料中提取活性蛋白质方法。 实验材料 起始缓冲液： 0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0） 洗脱液： 50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液） 500mM NaCl溶液150mL（溶剂：起始缓冲液） 再生溶液：0.5M NaOH溶液 仪器：磁力搅拌器等 其他材料：新鲜鸡蛋 实验流程 样品的预处理 静态吸附和洗涤 动态洗脱杂质和溶菌酶 再生树脂 洗涤管道 背景知识 蛋清中的溶菌酶 一种碱性球蛋白，Mw＝14700Da， pI＝10.5~11.0，在酸性条件下（pH4～7）较耐热，而在中、碱性条件下热稳定性较差。 蛋清中主要的蛋白质 卵白蛋白，占54％，pI＝4.5～4.8，分子量约为 45000Da； 卵伴白蛋白，pI＝6.05～6.6，分子量约为 70000~78000Da； 卵球蛋白，pI＝5.5~5.8，分子量约为36000～45000Da； 卵类粘蛋白，pI＝3.9～4.3，分子量约为28000Da； 卵粘蛋白粘度较大且不溶于水。 实验原理 蛋清中的蛋白质大多数呈酸性或者弱酸性，在pH＝ 7.0的条件下，这些蛋白质带负电荷或者少量的正电 荷；而等电点约为11.0的溶菌酶带正电荷，牢固地 吸附在阳离子交换树脂上，再通过不同离子强度的 NaCl溶液将弱酸性蛋白质和溶菌酶分级洗脱下来。 离子交换层析分离溶菌酶 [Na+] 阳离子交换树脂 阳离子交换树脂 阳离子交换树脂 ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + - - - - - - - - - 静态和动态离子交换法 静态离子交换法 优点： 操作简单； 设备要求低； 适合于粘度较高的样品。 缺点： 交换不完全； 不适宜用作多种成分的分离； 而且树脂有一定的损耗。 动态离子交换法 优点： 分辨率高，适合多组分样品的分离； 交换完全； 洗脱液中溶质浓度高； 缺点： 设备要求高； 操作参数多。 洗脱 定义：离子交换（即吸附）完成后，将树脂上吸附的物质重新转入（即解吸附）溶液的方法。 洗脱方法： 改变离子强度，在缓冲液中加入适当的KCl、NaCl等非缓冲盐类。 改变pH值，用缓和的酸或者碱洗脱。 洗脱方式 分阶段梯度洗脱：先采用洗脱能力弱的溶液，使易解吸附的组分流出，然后依次使用洗脱能力强的溶液，解吸附较难洗脱的组分。 连续梯度洗脱：其洗脱效果优于分阶段梯度洗脱，适合于高分辨率的分离目的，或者摸索分阶段梯度洗脱的条件。 离子强度 分阶段洗脱 连续洗脱 离子强度 洗脱峰 洗脱峰 连续梯度洗脱的装置 C = CB -（CB - CA）（1 - V2/V1）B1/A1 CA 、CB ＝梯度混合器A瓶、 B瓶的浓度； A1 、B1 ＝A瓶、B瓶的横切面积； V2＝流经层析柱的体积，V1＝梯度洗脱液的总体积。 总结 离子交换的操作流程 树脂的选择（阳离子交换树脂还是阴离子交换树脂） 树脂的预处理（盐型还是氢型、羟型） 缓冲液的种类、pH值和离子强度 洗脱 树脂的再生 离子交换的操作参数 流速（吸附的速度和洗脱速度） 样品的体积和浓度 实验步骤 样品的预处理 取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。 静态吸附和洗涤 静态吸附溶菌酶：倾出层析柱中平衡好的树脂，倾去多余平衡缓冲液，将蛋清溶液倒入树脂中，在磁力搅拌器上轻轻搅拌，室温下搅拌吸附约45min，注意搅拌速度（勿起大量泡沫、勿打破树脂）。吸附结束，吸取 200μL 上清于 dorf管中、4度保存备用（标记“1”），倾倒上清。 洗涤杂质：取与树脂体积相当的起始缓冲液搅拌洗涤树脂约5min，重复2次，每次洗涤后，吸取 200μL 洗涤液于 dorf管中、4度保存备用（标记“2”“3”），倾去洗涤液。 动态洗脱 用少量起始缓冲液将树脂调匀，重新装填层析柱，装填结束后，用起始缓冲液（用滴管沿层析柱内壁缓缓加入，勿冲击树脂面，高度约2cm即可）封闭树脂面，将层析系统组装好，核酸蛋白检测仪调基线（T档调“100”，A档调“0”），开始用 50mM NaCl洗脱液恒速洗脱杂质。（流速约2~3mL/min) 2. 洗脱杂蛋白：洗脱开始，即计时，然后每隔2min，记录下吸光值和电导率值（使用LP层析系统的同学记录电导率值），当洗脱峰结束（流出液的吸光值从开始上升到下降，直至平稳），洗脱完成。在洗脱峰