实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化教材.ppt

实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化 实验目的和要求 学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞； 学习用热激法将外源基因导入感受态细胞。 实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项 一、实验原理（CaCl2法、热激法） 1、几个概念 转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，如DH1、DH5、MM294、JM108/109、DH5α等， 常用 RM 符号表示。 转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法 感受态细胞(competent cell) ：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。 2、CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 正在生长的大肠杆菌在0℃下加入到低渗的冰冷的氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀形成原生质球，并同加入在转化混合物中的外源质粒DNA或λ噬菌体DNA形成一种黏着在细胞表面上的对DNase抗性的羟基钙磷酸复合物。转移到42℃下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞吸收。 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 3、影响感受态细胞转化效率的因素 （1）细菌的生长状态和密度 OD600=0.3~0.5，细菌生长处于对数期或对数前期。 （2）质粒DNA 质粒DNA不超过感受态细胞体积的5%。 质粒DNA的性质也会影响转化效率，分子量越大，转化效率越低，超过30kb的质粒DNA很难转化成功。 超螺旋的DNA具有较高的转化效率，重组DNA效率低一些，环状DNA相比线性DNA转化效率高一些。 （3）所用试剂纯度、质量、器皿的洁净程度 （4）防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。 二、实验材料 l、仪器和材料 大肠杆菌(E. coli JMl09或DH5a菌株) 恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、离心机、100 mL离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、Ep离心管(1.5 mL微量离心管)、加样器、1000 μL和200 μL吸头。 2、试剂 (1) LB琼脂平板：2个无抗生素，2个含氨苄青霉素 (2) LB液体培养基：无抗生素1支(5 mL)，含氨苄青霉素2支(5 mL) (3) 0.1mol/L CaCl2溶液 (4) 质粒pUCl8/19或pBluescript II SK+/-等 三、实验步骤 (一) 纯化及活化菌种 (二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 (三) 质粒DNA转化感受态细胞 (一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ） 冻存菌在新鲜LB平板上，划线，37℃培养16~20 h。 挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基中，37℃培养过夜 取l mL培养液加到100 mL LB液体培养基中，37℃摇床培养2~3 h ，当其OD600为0.3～0.5时(细胞数108/mL)，立即取出，冰浴10～15 min。 单菌落 l mL培养液 (二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上清(可用加样器将残余液体尽量去净)。——收集沉淀 2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃，5000 r/min离心10min，弃上清。 ——CaCl2洗涤沉淀 3、各加2mL 0.1 mol/L冰冷的CaCl2-10%甘油溶液，重悬细胞，于冰上放置2 min。即制备成感受态细胞悬液。——制成悬液 4、取此细胞悬液200 μL分装到Ep离心管中，可于冰上保存一周；也可置于液氮速冻后于-70℃冰箱长期保存。——分装保存 (三) 质粒DNA转化感受态细胞 1．取5 μL质粒DNA(~50 ng)加入到分装后的200 μL的感受态细胞中，吹吸轻轻混匀，置于冰上30min； 2．将感受态细胞42℃热休克恰好90 s，迅速放入冰中，冰浴2min； 3．转化物涂布于LB琼脂平板上(含Amp)，待液体吸收完全后，37℃倒置培养12~16 h； 4、对照组（三组） 取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上。 制备的感受态细胞200 μL涂布于有Amp的LB平板； 质粒DNA用无菌水稀释后涂布于有Amp的LB平板 四、预期结果 对照组（1）在无Amp平板上产生大量菌落； 对照组（2）在有Amp平板上不生长； 对照组（3） 在有Amp平板上不生长； 被质粒转化的感受态细胞，有Amp平板上出现转化细胞