流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理解剖.pdf

1、流式细胞术简介 ? 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。 ? 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。 流式细胞术的特点 ? 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； ? 检测参数：多参数； ? 检测特点：单细胞水平分析； ? 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； ? 检测结果：精度高、准确性好； ? 可对目标细胞进行分选； 2、流式细胞术光信号检测 光信号的类型 ? 散射光信号：与标记荧光素无关， 是细胞的固有参数。 ?前向散射光(forward scatter, FSC)； ?侧向散射光(side scatter, SSC)。 ? 荧光信号 ? 自发荧光：微弱（核黄素、色素分子等）； ?特异荧光：荧光素分子发出的的荧 光比自发荧光强很多倍。 前向散射光FSC ? 激光器正前方1 -6度方向上有比较强的衍射光，即前向散射 光，FSC强度是d/ λ的函数( λ表示波长，d指细胞大小)， 所以FSC反映被测细胞的体积大小和活力。 侧向散射光SSC ? SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射 光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。 散射光的作用 ? 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。 粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 红细胞、死细胞和碎片 ? 通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。 粘连 死细胞 死细胞 细胞 或碎片 肿瘤细胞株FSC/SSC散点图 加药处理后FSC/SSC散点图 阈值：Threshold/Trigger ? 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必 须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。 ? FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。 5% 32% 默认阈值 升高阈值后 荧光素和荧光信号 ? 荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。 激发波长 ＜ 发射波长(荧光波长) Excitation wavelength Emission wavelength 常用荧光素 499nm ：蓝色荧光（Blue）； 500-549nm：绿色荧光（Green ）； 550-584nm：黄色荧光（Yellow ）； 585-615nm：橙色荧光（Orange）； 616-700nm：红色荧光（Red）； ≥700nm：远红外荧光（Far-Red）。 标记抗体的荧光素 激发光波长 发射光波长 荧光素分子 中