以mRNA为模版，逆转录获得cDNA。.ppt

实验三 RT-PCR 实验原理 逆转录 理论依据：真核生物结构基因有内含子 基因在转录水平的表达是不同的 实验原理：以mRNA为模版，逆转录获得cDNA。 PCR 理论依据：半保留复制原理 DNA双链碱基互补 在不同温度下变性与复性 实验原理：以cDNA为模版经复制以几何级数扩增同一序列，获得大量相同DNA序列 逆转录原理 理论依据 真核生物基因多为断裂基因，编码区不连续，需经转录后加工，才能成为成熟mRNA。 以真核成熟mRNA为模板合成cDNA，则获得有连续氨基酸编码的DNA序列，无需转录后加工，可在原核细胞中表达。 基因转录水平与分化、调节、疾病等相关 内含子 外显子 实验原理 以mRNA为模板、根据polyA尾设计的Oligo(dT)为引物，在逆转录酶催化下合成cDNA。 AAAAAAAAA- 3’ AAAAAAAAA- 3’ agTTTTT- 5’ agTTTTT- 5’ 逆转录酶 PCR原理 理论依据 DNA双链在体内外均可解链，分别作为模版指导子链的合成。 DNA双链碱基互补，以氢键相连 随着温度的升高， DNA双链间的氢键断裂，DNA变性成单链。随着温度缓慢降低，双链重新形成，DNA复性。 实验原理： 94—95℃ DNA模板(双链) 变性解链(单链) 单链DNA模板与引物退火 两段引物分别与待扩增靶DNA两端互补决定了扩增产物的大小和特异性。 引物量＞模板量 故引物与模板的退火远大于 引物短，不易缠绕 模板双链自身的退火 引物3’-OH在DNA聚合酶作用下沿单链模板延伸 模板方向 3’→ 5’ 延伸方向 5’→ 3’ 催化酶 逆转录酶 天然逆转录酶具有逆转录、RNase H 及DNA聚合酶活性。为避免RNase H对反应体系中模板RNA的破坏，多被缺失。 逆转录酶有禽源与鼠源两种。禽源逆转录酶的最适反应温度高于鼠源，有利于克服RNA的二级结构，因此反应效率更高。 耐热DNA聚合酶 嗜热水生菌中获得的Taq酶，缺乏校读活性，突变频率千分之一，适合检测基因转录水平。 具有校正活性的耐热DNA聚合酶（高保真DNA聚合酶），适合扩增需克隆的基因。 引物 逆转录引物 Olig(dT)可与mRNA的polyA互补，特别在其3’端添加两个随机核苷酸的锚定引物，在引导合成cDNA时效率很高。 随机引物对RNA种类没有选择性，特异性低。且随机引物与mRNA结合部位不固定，因此不适宜全长cDNA合成。只有当mRNA缺乏polyA或RNA模板完整性较差时，选用随机引物合成cDNA 。 PCR引物 引物决定退火温度 退火温度＝A/T数目×2＋G/C数目×4 两条引物总浓度应为1pmol/μl左右 操作步骤 逆转录 PCR (一) 逆转录 取消毒的0.5ml离心管，加入下列成分： 总RNA 1-5μg （根据浓度计算RNA模板要用量） Oligo(dT)引物 1μl dNTP Mix (10mM) 1μl 加入无RNA酶的ddH2O至总体积15μl，混匀。 置65℃保温5分钟，放于冰上。再加入下列成分： 5×first-Strand Buffer 4μl MMLV(逆转录酶) 1μl 混匀，42℃保温1～1.5小时。70℃保温15分钟。 逆转录步骤说明 65℃条件下，RNA二级结构被破坏。变性后置于冰上迅速冷却，可防止RNA二级结构的再形成，有利于RNA模板与引物的结合。 70℃可导致逆转录酶变性失活，防止其对后续反应的干扰。同时也可分离cDNA第一链与模板mRNA。 (二) 特定基因的PCR扩增 取消毒的0.5ml微量离心管，加入下列成分： ddH2O 16.5 μl 10×PCR Buffer 2.5 μl dNTP(2.5mM each) 2 μl 逆转录产物 1 μl 引物混合物(10μM each) 1 μl Taq DNA polymerase 1 μl 混匀，加石蜡油1滴，离心4000转1分钟。 热启动： 94℃变性3min 扩增程序：94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸1min，共反应35个循环。 PCR步骤说明 以GAPDH作为对照组扩增时应与实验组反应体系一致，只是引物不同。可先配制不含引物的双倍反应液，均分为两管，再