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蛋白质工程3课件.ppt
第三章 蛋白质的修饰和表达 第三章 蛋白质的修饰和表达 第一节 蛋白质修饰的化学途径 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达 第一节 蛋白质修饰的化学途径 一、功能基团的特异性修饰 二、基于蛋白质片段的嵌合修饰 一、功能基团的特异性修饰 在20种天然氨基酸的侧链中,大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损,其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。 因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次,如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时,正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧基基团,尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别,但在化学上很难将肽链的?-氨基或?-羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。 一、功能基团的特异性修饰 1.多位点取代 2.单一的或限制性取代 3.次级取代 1.多位点取代 (1) 常规的氨基保护 (2) 亚氨代乙酰基 (3) 其他的侧链取代 2.限制性取代 (1) ?-异硫氰酸苯酯对?-氨基的选择性 (2) 羰基二酰肼的亲核取代 (3) 蛋白醛 (4) 通过蛋白质水解的逆反应产生蛋白和肽的?-酰胺 (5) 蛋白醛—由糖的化学氧化产生 3.次级取代 (1) 与蛋白醛偶联—亲核取代物 (2) 与蛋白质活性亲核物偶联—醛取代物 二、基于蛋白质片段的嵌合修饰 通过非共价键相互作用、二硫键、常规肽键(通过化学法或酶法产生)或其他非肽共价键,可以将较小的肽段连在一起,这就是通过半合成对蛋白质进行工程操作的原则。 二、基于蛋白质片段的嵌合修饰 1.通过非共价缔合系统产生嵌合蛋白质 2.二硫键与嵌合蛋白质的形成 3.嵌合蛋白质—通过化学激活形成肽键 4.融合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键 5.通过非肽键形成嵌合蛋白质 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造,在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 根据其特点,可将基因突变分为两大类:位点特异性突变和随机突变。 位点特异性突变又可大体分为三种类型:一类是通过寡核苷酸介导的基因突变;第二类是盒式突变或片段取代突变;第三类是利用聚合酶链反应(PCR),以双链DNA为模板进行的基因突变。 可以这样说,PCR技术的出现为基因的突变,基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。 1.编码基因的专一性位点突变 专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的,因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变。这种突变的方法从问世至今不断更新,特别是PCR技术出现后变得更高效。 (1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 ① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 2.区域性定向突变 基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变,也可以产生区域性的突变。 常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis),又称片段取代法(DNA fragment replacement)。 这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点,用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。 研究目的 通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构-功能之间的关系,也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋白质中,蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基酸序列来置换。 盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家族,在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域,从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。 二、基因融合和基因剪接 1.利用基因融合技术表达外源基因的缘由 2.基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体 3.蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接 基因融合的用途 上述这些基因融合策略,主要是有利于外源基因的表达、表达产物的分离、纯化以及细胞定位。作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。 第三节 重组蛋白质的表达 重组蛋白质在大肠
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