蛋白质工程在医药工业中的应用课件.pptVIP

蛋白质工程的应用 第一节　抗体工程 抗体(antibody)是抗原刺激人或动物机体的免疫系统后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的、能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。 抗体可与细菌、病毒或毒素等抗原结合，并通过特定的方式清除异物。 第一节　抗体工程 抗体工程(antibody engineering)是通过对抗体分子结构和功能关系的研究，有计划地对抗体蛋白序列进行改造，改善抗体某些功能的技术。 抗体的分类 根据抗体的制备方法和技术，将抗体分为多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三类。 抗体的分类 多克隆抗体：传统的抗体制备的方法是将天然抗原经过各种途径免疫动物，因为抗原性物质具有多种抗原决定簇，所以刺激机体产生了多种B细胞克隆针对不同抗原决定簇产生的混合抗体，并合成和分泌各抗体到血清和体液中，这种用体内免疫法所获得的免疫血清。 抗体的分类 单克隆抗体：同一克隆的细胞可合成和分泌在理化性质、分子结构、遗传标记及生物学特性等方面都完全相同的均一性抗体。 * 单克隆抗体 当抗原进入体内，在机体中就会诱导出针对不同抗原决定簇的多种抗体，如果要把这些抗体一一分开，用现有的生物化学或物理化学方法是根本办不到的。1975年科勒和米尔斯坦将小鼠免疫细胞与肿瘤细胞融合，培养出既能迅速生长繁殖又可分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。从而获得针对某一特殊抗原决定簇的单克隆抗体。 * 南京农业大学 生命科学学院 1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies) 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。 构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。 构建重组表达载体 克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。 人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。 人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。 2 鼠单抗可变区的人源化 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR即互补决定区。Ig超变区氨基酸残基的种类和顺序特别多变，这些部位与识别抗原直接相关，为Ig分子的抗原结合部位，故称为互补决定区。 CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。 经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体） 人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。 全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。 定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。 研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。 定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。 研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。 小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。 小分子抗体有很多优点: 可以用细菌发酵生产，成本低; 分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。 3 小分子抗体 Fv ScFv 单区抗体 最小识别单位 Fab 由完整的轻链和Fd组成，大小为完整