枯草杆菌摇瓶发酵生产α-淀粉酶课稿.ppt

生物技术实验——酶工程部分 摇瓶发酵生产α-淀粉酶 一、实验目的 掌握酶的发酵生产方式之——微生物发酵产酶； 学习和掌握摇瓶培养的方法。 二、实验原理 酶可由动物（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）、植物（如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶）和微生物（细菌、霉菌、酵母）产生，其中工业酶制剂大多数由微生物发酵法生产。 由于微生物世代时间短，繁殖快、容易培养和管理，可大规模工业化生产，所以工业酶制剂大多由微生物发酵产生。 产酶微生物的获得： 1、从有关菌种保藏机构购买 2、从自然界分离筛选 产酶微生物的分离筛选方法 1)样品的采集：从富含酶作用底物的场所采集样品。 2)富集培养: 投其所好，取其所抗。 3)分离获得纯培养(pure culture)的微生物。 4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。 5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。 产酶工艺条件及其调节控制 酶制剂的发酵生产过程图解 30升全自动发酵罐 发酵工艺参数的控制 pH的调节控制 温度的调节控制 溶解氧的调节控制 泡沫的控制 染菌的控制 酶的提取与分离纯化的工艺流程 酶活力的测定 酶活力： 也称酶活性，酶催化一定化学反应的能力。 酶活力大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的起始速率V0表示，即用反应起始阶段产物增加(或底物减少)的速率表示。 酶活力测定方法 酶活力测定的要求：快速、简便、准确。 包括两个阶段： 1、将酶与反应底物混合均匀，在一定条件下反应一段时间； 2、测定反应液中底物或产物的变化量。 酶活力测定的基本步骤： (1) 根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。 (2) 根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。 (3) 在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。 (4) 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。 注意：若不能即时测出结果的，则要及时终止反应，然后再测定。 终止酶反应的方法： 加热使酶失活； 加入适宜的酶变性剂（如三氯醋酸）； 调节pH值； 低温终止反应。 酶活力测定方法 根据测量操作过程 终止反应法：在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一定时间取样，终止反应，进行测定。 连续反应法：基于反应过程中光谱吸收、酸碱度等变化用仪器跟踪反应的进程、记录结果。 酶活力测定方法 根据底物或产物的物理化学性质 化学测定法、光学测定法、气体测定法等。 如化学滴定、比色法、紫外光吸收、荧光测定、同位素标记底物或称放射性化学法、酶偶联法等。 其中化学滴定、紫外、可见光比色法最为常用。 酶的反应速度的影响因素 酶的反应速度受到许多条件的影响：底物浓度、温度、pH、金属离子等 要准确地测定酶的活力，必须满足这些前提条件。 最适反应条件：最适底物浓度、最适pH、最适温度、最适离子强度、必要的辅助因子；保证测定的是V0，即线性部分 酶活力单位 国际单位： 1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定：在特定条件下，每1 min 催化1 μmol 的底物转化为产物的酶量定义为1 个酶活力单位。这个单位称为国际单位（IU） 国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（Kat）。在特定条件下，每秒催化1 mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（Kat）。 酶的比活力 酶的比活力是酶纯度的一个指标，是指在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。 酶活力：样品中酶总共有多少个酶单位。 比活力：每mg蛋白质中有多少个酶单位。 酶比活力＝酶活力（单位）/ mg （蛋白或RNA） 可用以比较每单位质量酶蛋白的催化能力。 对同一种酶，比活力可以代表酶的纯度，比活力愈高，表示酶愈纯。在酶纯化过程中，比活力增高。 淀粉水解酶类 凡是能催化淀粉（或糖元）分子及其分子片段中的α-葡萄糖苷键水解的酶，统称为淀粉酶，包括α-淀粉酶，糖化酶，β-淀粉酶，异淀粉酶，环状糊精生成酶，麦芽寡糖生成酶等。 广泛应用于淀粉糖工业、酒精、啤酒、味精、酿造、烘焙、饲料、纺织退浆、医药等领域。 α-淀粉酶alpha-amylase 能水解淀粉分子链中的α-1, 4-葡萄糖苷键，将淀粉链切断成为短链糊精和少量麦芽糖和葡萄糖，使淀粉粘度迅速下降的酶制剂。 产品分类 按产品的适用温度分为: 中温α-淀粉酶制剂和耐高温α- 淀粉酶制剂。 按产品形态分为： 液体剂型酶制剂和固体剂型酶制剂。 中温 α-淀粉酶 中温 α-液化型淀粉酶系用枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis)经发酵提炼精制而成。 用 途： 本产品适用于酒