实验四革兰氏染色法一.ppt

实验四 革兰氏染色法 一、目的要求 1 学习革兰氏染色原理，理解着色机理。 2 掌握革兰氏染色的方法，并能正确染色。 3 巩固无菌操作技术 4 巩固显微镜油镜的使用方法 二、基本原理 革兰氏染色是用于细菌鉴别的一种重要染色方法。它是根据革兰氏阳性细菌、阴性细菌细胞壁结构、组成的不同而使用一系列的染色处理使之差别显色。其染色方法是先将细菌分别用结晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂复染。最终被染成红色的是革兰氏阴性细菌；被染成紫色的是革兰氏阳性细菌。 革兰氏染色原理： 第一步：结晶紫使菌体着上紫色 第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。 第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。 三、实验材料 大肠杆菌（24h培养）斜面菌种 枯草杆菌（12h培养）斜面菌种 四、方法步骤 1　涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。 2　初染：滴加结晶紫染色1min，后用水冲洗。3　媒染：滴加碘液染色1---2min，后用水冲洗，甩尽残余水 4　脱色：用95%乙醇冲洗30秒（需要严格控制时间和浓度），然后立即用水冲洗。 5　复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，蕃红染2---3min，如果石炭酸复红染1min。水洗，晾干。 6　镜检：先用低倍镜观察，后用油镜观察 实验5. 微生物细胞大小测定 一、实验目的 学习用镜台测微尺校正目镜测微尺的方法★ 学习并掌握用目镜测微尺测定细菌细胞大小的方法★★? 巩固显微镜油镜的使用方法 二、实验原理 测定微生物细胞大小是在显微镜下利用测微尺进行。测微尺可分为目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是特制的圆形玻片，中央有一刻度尺（100等分），可放入目镜镜筒内，用于测定细胞大小。镜台测微尺为一载玻片，上贴有圆形盖片，中央有总长度为1mm(100等分)，每小格长0.01mm(10um) 。目镜测微尺每小格大小随显微镜放大倍数不同而改变，使用目镜测微尺进行测量之前必须用镜台测微尺标定，以求出在某一放大倍数下目镜测微尺每小格所代表的长度，然后用标定好的目镜测微尺进行测量。 三、 实验材料 枯草杆菌标本片 四、实验方法步骤 1）用镜台测微尺标定目镜测微尺。 2）用目镜测微尺测定枯草杆菌大小。 （1）用镜台测微尺标定目镜测微尺。 放置目尺：取出目镜，旋开接目镜，将目尺放在目镜镜筒的中间隔板上（有刻度的一面朝下），旋上接目镜，并插入镜筒。?? 放置台尺：将台尺放置于显微镜的载物台上，使刻度面朝上。?? 标定目尺：先用低倍镜观察，找到台尺刻度，转动目镜使目尺与台尺的刻度轴线相平行，移动台尺使目尺与台尺某一区间的两对刻度线完全重合，然后计数出两重合线间各自所占格数，通过如下公式计算： 数标定低倍镜目尺每小格所代表的实际长度 （2）用目镜测微尺测定枯草杆菌大小 取下台尺，将染色片放在载物台上，先用低倍镜观察，后换油镜观测，计量细菌长和宽所占小格数，将测得格数乘以已标定的目尺每小格长，即得菌体实际大小。测定20个菌体求出平均值。 实验报告：（1）目镜测微尺标定结果记录（2）在油镜下测量枯草杆菌大小结果记录 下次实验：6-8 * * 1 目尺每小格长度（um）= 两对重合刻度线之间台尺所占格数×10 两对重合刻度线之间目尺所占格数