1-2基因工程操作程序讲解.ppt

基因的结构： 基因组文库与cDNA文库的比较（P10） * 1-2 基因工程的基本操作程序 ▲基因工程的基本操作程序主要包括 四个基本步骤 1）目的基因 的获取 2）基因表达载体的构建 3）将目的基因导入受体细胞(即“转化”) 4）目的基因的检测与鉴定 步骤一：目的基因的获取 1、什么叫目的基因? 主要是指编码蛋白质的基因. 3、获取目的基因的方法有哪些? 1）从“基因文库”中获取. 2）利用“PCR技术”扩增. 3）直接人工合成 (适合于基因较小且已知其核苷酸顺序) 2、目的基因的来源? 可从物种中分离、也可人工合成. 什么叫“基因文库”? 分为: ①基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. ②部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库。如cDNA文库. 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。 （类似从图书馆里取书） 真核细胞的基因 原核细胞的基因 有 无 内含子（有无） 某生物全部基因 某生物部分基因 基因多少 部分可以 可以 物种间的基因交流 有 无 启动子（有无） 大 小 文库大小 基因组文库 cDNA文库 文库类型 ▲利用PCR技术扩增“目的基因” 1.概念: PCR即“聚合酶链式反应”,是一种在生物体外复制特定DNA片断的技术. 2.原理: DNA复制. 3.过程: (见P10图1-8). 4.优点: 大量获取目的基因.(指数式扩增, 近2n) ▲提示与思考: 1.模板： 目的基因 2.引物： 与模板DNA互补的单链 3.底物： 4种脱氧核苷酸 4.酶： 热稳定DNA聚合酶 5.Mg2+： DNA聚合酶的激活剂 高温变性 （呈单链） 低温退火 （引物与模板DNA结合） 中温延伸 （合成DNA子链） PCR技术的3个步骤： ▲人工合成目的基因 如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接合成。 1)通过反转录法合成: 目的基因的mRNA(已知) 单链DNA 双链DNA (即目的基因) 反转录 合成 合成方法 反转录法 直接合成 2)直接合成 已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，再推测出它的结构基因的核苷酸序列，通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 步骤二 基因表达载体的构建（是核心） 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切取目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 目的基因与载体的结合过程，实质是不同来源的基因重组的过程 构建步骤： 1）基因表达载体： 2）基因表达载体的组成： 就是指已插入目的基因的载体. a. 目的基因： b. 启动子: c. 终止子: d. 标记基因: e. 复制原点: b.启动子: 位于目的基因的首端,是RNA聚合酶的识别和结合的部位.有它才能驱动目的基因转录出MRNA.最终获得蛋白质. (不是复制!) c.终止子: 位于目的基因的端尾端，作用是终止转录. d.标记基因: 是为了鉴别受体细胞里是否已经含有目的基因,从而将含目的基因的细胞筛选出来.如“抗生素基因”、“荧光标记基因”等. e.复制原点: 是载体复制(不是转录)时的起点. ▲指将目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定(如复制)和表达(即转录、翻译为特定蛋白质及表现特定性状等)的过程. ▲提示: 注意,目的基因是随着基因表达载体被导入受体细胞的,而不是被单独导入的. 步骤三 将目的基因导入受体细胞 受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 （双子叶植物和裸子植物） 农杆菌转化法 基因枪法： 花粉通道法： 1）目的基因导入植物细胞方法： （单子叶植物） （植物受精卵） 2）目的基因导入动物细胞方法： 显微注射法（技术） 用口径为1μm的DNA注射器，将大量目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。 3）目的基因导入微生物细胞—感受态细胞法