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SSR标记实验步骤 简介： SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。 优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；（2）是共显性标记，呈孟德尔遗传；（3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。 开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高。 DNA提取 按照Doyle和Dickson(1987)CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改进的程序进行，具体步骤如下： 成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml离心管中，-20℃冰箱保存； 加入600ul 65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30～60分钟； 取出，冷却，上下摇匀后，加入600微升24:1的氯仿异戊醇； 12000转/分钟离心10分钟，取上清液于另一个1.5ml的离心管中； 加异丙醇，12000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液； 干后用100%的洒精清洗，干后加适量TE 2、PCR扩增 模板DNA的浓度大约25ng/ul，扩增反应体系为20ul。具体如下： Sterile ddH2O 11ul PCR Buffer 3ul dNTP-mix 0.5ul Primer1 1ul Primer2 1ul Taq polymerase 0.5ul(2U/μL) DNA 3ul PCR扩增程序为：（2h30min） 预变性：94℃，5分钟； 变 性：94℃，40秒； 退 火：55℃ 40秒； 延 伸：72℃，1分钟； 循 环：从2到4共38个循环； 72℃下最后延伸5分钟；4℃ 5min,扩增产物置于4℃的冰箱保存。 3、扩增产物的电泳分离 制胶→灌胶→上样→电泳 扩增产物用8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，步骤如下： 准备电极液（1×TBE）； 将梳子拨出，并迅速用电极液冲洗胶面； 不预电泳； 点样，电泳220v； 拆板，并及时将内板、边条及梳子洗净。 4、凝胶染色 固定：10%醋酸，5分钟； 染色：10分钟； 漂洗：dH2O，510秒； Na2S2O3 1min 显色：甲醛- NaOH,直到满意为止； 漂洗：dH2O， 5、自封带封胶，读带标记，数码照相摄像，室温风干。 模板DNA含量是制约扩增结果的一个重要因子。浓度太低，分子碰撞的几率低，偶然性增大，扩增产物不稳定；模板含量过高造成条带模糊，甚至不能扩增出条带，20 ng时扩增出的条带较其他浓度都清晰可见. 在PCR反应中，dNTP浓度应在20～200／~mol／L之间 。结果表明，随dNTP浓度的增加，条带越来越清晰。dNTP浓度达200~mol／L时，DNA条带最清晰。 引物浓度对DNA条带的影响较小，没有明显的差异。但对于PCR而言，引物和基因组靶序列的摩尔比至少为108 ：1，这样过量引物才能确保模板一旦变性就等于引物退火，而不是自身退火。引物与模板比对PCR的特异性也非常重要，如果引物模板比太高，则易产生非特异性产物，而且容易产生二聚体；但如果比例太低(小于基因组DNA标准PCR反应条件的0．1％)，反应结果会很差。所以考虑引物的适宜浓度为0．15 umol／L. 在PCR反应中，Taq酶的用量也是影响试验结果的一个重要因素。使用高浓度的Taq酶不仅成本过高，而且容易产生非特异性扩增产物；Taq酶浓度过低则会导致产物的合成效率下降。一般随机扩增反应中，Taq酶的用量在0．5～5 u之间 J。试验表明：0．1 uL(5 u／ )时DNA条带清晰可见。随浓度的增加，弥散背景加深。故选择0．1 t~L(5 u／ )，即0．5 u作为最适Taq酶用量。 不同引物随着退火温度降低，非特异性产物增加，电泳检测条带不清晰，有弥散背景；退火温度升高，特异性相对增加，可以扩增出清晰的条带；退火温度再提高后扩增量减少，甚至导致无扩增产物。最终在已确定的反应体系条件下确定了每对引物的最适退火温度。 确定模板DNA的浓度是试验成功的关键。SSR反应体系中dNTP，Taq DNA聚合酶，引物，Mg