单克隆抗体和基因工程抗体的制备解读.ppt

1. 噬菌体显示 指将蛋白分子或肽段基因克隆到丝状噬菌体的基因组 DNA 中，使噬菌体表面表达该异源性分子，主要特点是在同一病毒颗粒内将特定分子的基因型和表型统一，在噬菌体表面表达特定蛋白，在该噬菌体核心DNA中含有该蛋白的基因。 （二）噬菌体抗体库技术 2. 噬菌体抗体 将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之表达在噬菌体表面，形成噬菌体抗体，将全套抗体可变区基因，组装到表达载体，其抗体表达到噬菌体表面，得到噬菌体抗原。 在诊断、治疗中具重要意义，还有人源性抗体比鼠源性抗体的副作用低，很有发展前途。 1. 在抗感染中的作用 对细菌产生的毒素、病毒感染。 2. 在肿瘤治疗中的作用 一是抗体直接作用于肿瘤，一是抗体连接药物、毒素、酶及细胞因子等。 3．抗独特异抗体 抗原内影像来代替相应抗原，因为这种抗原量少或难于获得。 （三）抗体库的应用 Ag Id 抗-Id 抗原的内影象 第三节 基因工程抗体技术 杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、预防和蛋白质提纯应用中非常广泛，但对人是异源性，人抗小鼠抗体，应用基因工程技术减少小鼠源成分，保留原有的抗体特异性。 一、人源化抗体 人源化抗体主要指鼠源性单克隆抗体的基因克隆及 DNA 重组技术改造，重新表达的抗体。其大部分氨基酸序列为人源序列所取代，既基本保留亲代鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了鼠异源性。 （一）人-鼠嵌合抗体 通过基因工程技术将人 IgG C 区与鼠IgG V 区连接，导入细胞内表达制备的抗体称为嵌合抗体，因 IgG 的抗原性在 C 区，来自人，故抗原性降低，且半衰期明显延长，在介导 CDC 及 ADCC 亦明显增强。 1.鼠单克隆抗体可变区基因克隆 用探针从该杂交瘤细胞的基因组文库中调取。用 PCR 方法从该细胞的 RNA 中扩增 VH 及 VL 基因。 2. 表达载体的构建 人-鼠嵌合抗体的表达载体基因依可变区基因克隆的表达方式不同而分为两类，从基因文库所克隆的可变区基因带有上游的转录调控组件及内含子剪接信号，因此载体只需要包括细胞内增殖所必须的抗生素抗性基因和质粒复制的起始序列以及在真核细胞进行选择的显性标记基因。 将载体 DNA 导入真核细胞称为转染。导入的 DNA 整合至细胞基因组 DNA 中得到转染子，要得到稳定的转染子需利用真核细胞的显性选择标记基因，这些标记基因使细胞获得对某些细胞毒物质的抗体，在培养液中加入相应的细胞毒物质可杀死转染不成功的细胞，达到选择的目的。 3.表达 用哺乳动物细胞或大肠杆菌表达量较少，而应用二氢叶酸还原酶（dhfr）扩增系统使抗体表达增强。dhfr 是正常核酸代谢必须的酶，缺乏该酶的中华仓鼠卵细胞（ CHO））需在有次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷条件下利用 DNA 合成，因此, dhfr 作 CHO 的显性选择标记基因，在无次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情况下，只有导入 dhfr 基因，细胞才能存活。该糸统可用来扩增导入的目的基因。 (二) 改形抗体（reshaped antibody,RAB） 应用基因工程技术在嵌合抗体基础上用人抗体可变区序列取代鼠源单抗CDR以外的骨架序列，重新构成既有鼠源单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体，该抗体对人无免疫原性。 （三）抗体的表面修饰 人和鼠 IgV区来自不同的种属，轻链不同型别，互补性决定区(complementarity determining region,CDR) 的长度可不一致，但暴露于表面的AA残基的位置数量都很保守，通过改变表面残基使其人源化，降低鼠可变区的异源性，将Fv的表面人源化，消除其免疫原性而不影响 Fv 的整体空间构象。 （四）双特异性抗体 双特异性抗体（bispecific antibody,BsAb）又称双功能抗体。两个抗原结合部位具有不同的特异性，可以同时与两种不同特异性抗原发生结合。 1.化学交联BsAb 分别分离纯化两种抗原的单抗，先使Ig解离后，获得单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来。该方法易致抗体失活，其产物也难以保证均质性。 2.细胞工程BsAb 将二种杂交瘤细胞进行融合产生杂交瘤，核酸随机组合多种多样。 3.基因工程BsAb 用抗体分子片段如ScFv或Fa