ARDRA分析方法在假单胞菌分类鉴定中的应用.pdf

ARDRA分析方法在假单胞菌分类鉴定中的应用 695 ARDRA分析方法在假单胞菌 分类鉴定中的应用 年洪娟1张杰1黄大坊2 (1．中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100094； 2．中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081) RibosomalDNARestriction 摘要：ARDRA(Amplmed 代分子生物技术，广泛用于新菌株的发现、细菌的系统分类及遗传多样性的检测等方面。文章综述了近年 来ARDRA技术应用于假单胞菌分类鉴定中的研究进展。 关键词：ARDRA分析；假单胞菌；分类鉴定 核糖体DNA(rDNA)是编码核糖体RNA的基因，在细胞核中以重复连续排列的方式存 003—10 在，每个细胞中的拷贝数目在l 000之间。由于rRNA具有高度的保守性，因此可以 作为生物进化史上的计时器，其序列的相似程度可以反映它们在系统发育上的关系。16S rRNA具有高度保守序列，利用通用引物通过PCR反应获得大量的特异性片段。此外，不同 rRNA也 的微生物rRNA基因序列在进化过程中某些位点会以不同的几率发生突变，所以16S 含有可变序列，这一序列的差异导致特异性的限制性酶切片段长度(Restriction Fragment I上ngth 和系统发育关系。 1假单胞菌传统分类方法 假单胞菌属最早是Migula于1894年建立的，随后经历了从少数表型特征到生理生化和 化学分析，直到近年来采用包括遗传学的多元性分类3个阶段。自19世纪后半叶纯培养技 术发展以来，相继建立了模式菌株和菌种保存中心，测定的内容有生理性状、生化性状、血 清学性状、细胞成分分析，包括细胞壁的成分，如肽聚糖含量与组成、胞壁酸的种类、类脂 的含量、蛋白质电泳图谱等，这些大都属于化学分类范畴。直到1966年Stannier等人建立了 Kersters[5J等对假单胞菌属分类体系做了相应的补充修正。随着分子生物学和分子遗传学理论 和实验手段的不断发展，各种高精度分析系统的建立，已经能够区分微生物体内遗传物质的 微小差异，分子生物学手段与计算机的数值分类和聚类分析相结合，使假单胞菌属的分类水 平有了很大提高。 2分子生物学分类方法 近20年来，假单胞菌属的分类方法已从早期的表型性状法、数值分类法、脂肪酸图谱 法、血清法发展到目前的G+C m01％含量测定、核酸杂交技术和核酸序列分析等。特别是 以核酸杂交和PCR反应为基础的分子生物学技术，如16S rRNA基因序列分析、限制性酶切 片段长度多态性分析(RHP)、随机扩增片段长度多态性分析(Random AmplifiedPolymorphic Element DNA，RAPD)、重复序列聚合酶链反应(RepetitivePCR，REP—PCR)等在微生物的 696 农业生物灾害预防与控制研究 分类鉴定中得到应用和发展[6～9|。 3 ARDRA分析方法在假单胞菌分类中的应用 扩增性rDNA限制性酶切片段分析方法是1992年建立的[10]。ARDRA技术的原理是基于 rDNA)，再对rDNA片段进行限制性酶切片段长度多 PCR技术选择性扩增rDNA片段(如16S 态性分析。这项技术的步骤是：①提取总DNA，以总DNA为模板，rRNA基因的保守序列为 引物，PCR扩增rDNA片段；②选择2—5个识别四碱基酶切位点的限制性内切酶对扩增产物 进行限制性酶切；③琼脂糖凝胶电