实验四麦清蛋白的初步提取实验汇报.docxVIP

生物化学实验报告实验四麦清蛋白的初步提取一、研究背景及目的无论是在科学研究还是商业化产品的开发中，生物大分子的分离纯化似乎都是一个永恒的话题。针对某一类物质的分离，人们通过寻求它们之间的共性特征而发明了诸多的分离纯化技术。然而随着人们对某一特定目标产物活性与纯度的需求逐渐增大，但同类物质之间彼此性质的相似性使得精确的分级难度随之加大，二者之间的矛盾刺激人们不断探索新的技术以提高纯化水平。人们清楚地意识到，要想使目标物得到分离，目标物与杂质之间的性质差异必须足够大，这又与某些性质差异小的物质的分离相矛盾，而人为放大这些差异小的性质必然会破坏目标物的原有结构，因此需要借助第三者进行差异转化，即以其自身的性质为基础，转化为其他方面差异大的性质。层析法就是通过层析介质与流动相的共同作用，使被分离物质之间差异很小的性质随流动相的流动而转化成了速度上的差异，通过时间上的积累进而转化为距离上的差异。所以，从理论上来说，只要层析柱足够的长，纵使是很微小的速度差异也能够体现出一定的距离上的差异，从某种意义上来说对于层析法也就不存在无法分离的物质，这是层析法在生物大分子的分离纯化中占据主导优势地位的原因。此外，除了定性能力较差以外，层析法几乎囊括了物质分析纯化中的所有优点，比如分离效率高、速度快，样品用量少、检测灵敏度高、分析速度快、易于自动化管理等。基于不同的原理，层析法又衍生出诸多的操作技术，在实际应用中可以根据待分离物质的特定性质选择适合的操作技术。基于以上种种原因，层析法在分离高纯度、高活性的生物大分子中有着不可替代的作用。本实验以分子筛层析完成麦清蛋白脱盐为实例验证层析技术的可行性，了解相关技术的应用及新技术的发明对边缘性实验学科的重要作用，感悟技术发明的思路。二、原理1.硫铵分级沉淀中性盐沉淀的原理是大量中性盐加入使水活度降低，它们在争夺溶剂水的同时破坏蛋白质表面的水化层，使疏水氨基酸暴露，从而发生聚集沉淀下来。由于不同蛋白质所形成的双电层水膜的稳定性不一样，因此破坏他们所需的硫酸铵的浓度也不一致，所以我们可以利用不同浓度的硫酸铵来对样品液进行分级沉淀，特定的浓度可以使样品中一类蛋白甚至是一种蛋白质发生沉淀。显然，硫酸铵分级沉淀在对蛋白质的粗提取过程中实际上已经实现了精细分级（除去了一部分蛋白杂质），这符合实验设计中尽可能使每一步实现效益最大化的原则，所以被用作蛋白质粗分级中的常用手段。此外，硫酸铵还有其他的一些优势：（1）硫酸铵属于惰性物质，不易与其他生物活性物质发生反应，在纯化过程中能最大程度的保护蛋白质活性，不易使蛋白质变性；（2）硫酸铵为二价离子，等浓度时离子强度高，能更有效的降低蛋白质溶解度；（3）硫酸铵在水中的溶解度大、温度系数小，在低温时仍可以高浓度存在，既能够满足低温沉淀某些蛋白质的需要，又能有效争夺溶剂水和破坏蛋白质水化层，使蛋白质有效沉淀；（4）硫酸铵溶解性好也为后续的高盐纯化做准备，便于洗涤去除。2.凝胶过滤层析凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱；中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，由于分子量大小不同的物质被洗脱的时间是一定的，经过层析柱后，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。3.实验方案本实验选取麦清蛋白作为纯化对象进行研究，我们首先通过硫铵分级沉淀对小麦种子提取液做初步的提纯，得到含有硫酸铵杂质盐的麦清蛋白粗提取物，然后通过分子筛层析除盐，最后利用紫外分光光度计测定各阶段纯化产物的OD280以检测蛋白含量，同时用BaCl2检测纯化产物中有无硫酸根离子，最后对比分析麦清蛋白和盐的洗脱曲线来评判凝胶过滤层析的除盐效果。三、仪器与试剂仪器：UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）、JP-100架盘药物天平（常熟市双杰测试仪器厂）、TDL-40B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）、SL-200型高速多功能粉碎机（浙江省永康市松青五金厂）、BSZ-100自动部份收集器（上海沪西分析仪器厂）、HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；器具：微量可调手动移液器（大龙）、研钵；试剂：饱和（NH4）2SO4溶液、1%的BaCl2溶液、洗脱液、蒸馏水；材料：新鲜小麦种子、葡聚糖凝胶G-25。四、实验步骤[1]1.溶胀凝胶（教师完成）称取交联葡聚糖凝胶G-25适量，加入足量的洗脱液于沸水浴中溶胀5h。溶胀平衡后，适度搅拌使充分悬浮后稍静置，待大部分凝胶沉降后，除去含有细碎颗粒的上层液，