植物新基因克隆的策略与方法.ppt

技术流程 (1)提取两种细胞的mRNA,反转录后成为2种cDNA； (2) 以随即引物和猫定引物作随机聚合酶链反应； (3) 通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样品间的差异条带； (4)将差异DNA做成探针，或设计特异引物； (5) 在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析，或进行RT-PCR和RACE扩增基因。 技术特点 ①简单，技术上仅仅依靠PCR和DNA测序胶电泳； ②可以同时分析多组样品； ③灵敏性高，仅需0.2 μg总RNA作为起始材料，可检出低丰度mRNA； ④实验周期短，约8 d即可完成，便于重复； ⑤最突出的优点是实验过程中可步步验证比较； （1）假阳性率高，假阳性的比例有时高达50％～75％。 （2）由于某些序列的特异性，一些差异表达的转录不能得到分离，所以凝胶中的单条带可能由1种以上cDNA片段所构成。 （3）差异显示所得的cDNA片段较短，长度多在100 bp～400 bp之间，且大多位于mRNA 3′端约300 bp的非翻译区（untranslated regions,3′UTR）。 cDNA-AFLP技术 cDNA-AFLP（cDNA-amplified fragment length polymorphism）技术结合了RT-PCR和AFLP技术的分子标记技术。 原理 以纯化的mRNA为模板，反转录合成cDNA。用识别序列分别为6-bp和4-bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段与人工接头连接后，利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示。 技术流程 （1）模板的制备和cDNA的合成； （2）双链cDNA片段的酶切和人工接头的连接； （3）酶切片段的预扩增和选择性扩增； （4）凝胶电泳； （5）比较处理组与对照组电泳图谱，找出差异条带； （6）回收差异条带，PCR富集，克隆； （7）测序，功能注释，然后进行基因的全长克隆。 技术特点 - 需要的模板量少； - 重复性好，假阳性低，可检测低丰度表达的mRNA ； - 准确反映基因间表达量的差别； - cDNA-AFLP不需要预先知道任何序列信息，且实验操作简便，可在任何实验室进行。适合对生物体转录组进行全面分析。 抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH） SSH 即抑制消减杂交技术，是由Diatchenko 等于1996 年以m RNA 差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。 原理 通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试（tester）cDNA 片段的5’末端，将测试和驱动(driver)进行两轮杂交。标准化步骤均等了测试中的cDNA 单链丰度，消减杂交步骤去除测试和驱动之间的共同序列。利用抑制性PCR选择性扩增目的cDNA片段，同时抑制非目的cDNA 的扩增。 因此，抑制性消减杂交技术显著增加了获得低丰度差异表达的cDNA的概率。 技术流程 1) 测试材料：tester; 对照材料：driver； 2) cDNA合成：通过反转录获得cDNA； 3）cDNA酶切； 4) 加接头（adapter），将tester cDNA分成两组：tester 1和tester 2, 一份与Adaptor1连接，另一份与Adaptor2连接（5’端）； 5)第一次差减杂交,使连接一种接头的差异表达基因a初步富集 ； 6)第二次差减杂交,形成了新的连接有两种接头的双链杂交片段,作为PCR指数扩增的模板； 7）两轮PCR,特异扩增代表了差异表达的cDNA片段； 8）将PCR所得的差别表达基因片段插入适当载体,转化细菌。经筛选,获得具有差异表达cDNA片段的阳性克隆。然后通过序列分析,可获得一些新的ESTs序列。 技术特点 （1）假阳性率大大降低； （2）高敏感性； （3）速度快，效率高； （4）SSH还具有背景低，重复性好的特点。 应用 抑制性消减杂交技术已经被广泛地应用于各种植物功能基因的克隆。 RNA随机引物PCR指纹技术（arbitrarily primer PCR finger printing of RNA，RAP-PCR） RAP-PCR 技术由Welsh J 等1992 年提出。它是以PCR 为基础构建RNA 指纹图谱, 是研究基因差异表达的有效方法。 原理 以RNA 为模板，在低严谨度条件下反转录产生cDNA 第一链和第二链。随后用PCR 扩增来富集产物, 引物与反转录