浅谈全内反射荧光显微术及其在生物学中的应用10489028基础医学.doc

浅谈全内反射荧光显微术及其在生物学中的应用 摘要：全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术,它利用全内反射产生的隐失场来照明样品,从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。近年来，全内反射荧光显微术已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。本文简要介绍了全内反射荧光显微技术的基本知识及其在生物学方面的一些应用。 引言：世界上第一台光学显微镜的产生，使人们能够观察到肉眼不能观察到的东西。经过几百年的发展，经过物理学家的不断努力，显微镜的性能不断提高，成像质量大为改进。许多新的光学显微镜也应运而生，如偏振光显微镜、相差显微镜、倒置显微镜等。但是，在细胞生物学方面传统光学显微镜始终不能解决生物样本显微中的几个重要问题：1.显微图像的信噪比不高2.光源对生物样本照射的损伤3.光学衍射所致的分辨极限（R ≥0. 61λ/nsinθ）。而这三个问题恰恰是生物单分子探测中亟待解决的问题。 20 世纪30 年代电子显微镜的发展导致了细胞研究的革命,使得生物学家得以从亚显微水平上认识细胞世界。进入80 年代,非光学类扫描探针显微术特别是原子力显微镜的出现更是将成像的分辨率推进到纳米的精度。与此同时,新一代光学显微技术也应运而生，它们以其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对单分子活体探测的可行性,再次成为生物学家、物理学家和成像学家们研究的热点。目前国际上公认的最有前途的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术,近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[1]。这些技术在分子生物学、分子化学、激光医学及纳米材料等领域受到广泛关注,并产生了深远的影响。 全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术,它利用全内反射产生的隐失场来照明样品,从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。Hirsch field于1965年完成了第一个全内反射荧光实验,这是首次尝试用全内反射荧光法测液体中的单个分子的荧光。将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合的TIR-FM技术是一种全新的突破.虽然它的具体应用还不到10年的时间,但是它在单分子探测中已显示出强大的生命力.1995年,Yanagida小组用TIRFM技术首次在液体溶液中得到了荧光标记的单个蛋白质分子的成像.1996年,Moerner小组又用这项技术实现了限制在丙烯酰胺胶体的纳米孔中的单分子的三维成像. 至今,全内反射荧光法在理论上和应用上均已得到较大发展,出现了多种全内反射荧光法,如时间分辨全内反射荧光、多重内反射荧光和全内反射荧光相关光谱等方法。全内反射荧光配合偏振技术和时间分辨技术在研究表面分子或近表面分子的取向、旋转和荧光寿命方面已取得很好的效果。 全内反射的基本理论[2][3] 全内反射 全内反射现象是生活中的一种常见现象，如钻石的色彩斑斓和光纤的光线传播等。如图1所示 ，当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中。入射光在两介质接触面一部分发生反射，一部分发生折射。入射角θ1和透射角θ2之间满足关系 式 n1sin θ1=n2 sin θ2 （1） 若n1大于n2，由公式（1）可以看出当入射角增大时，透射角也增大。假设增大到临界角θc时的透射角为90°。当光线以大于或者等于临界角θc入射时，入射光在界面处只发生反射而不再透射进n2介质，也就是发生了全反射。由snell定律可知 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1) （2） 由上式可知，当n1大于n2时，全反射就可能发生。如果玻璃的折射率取为1.52，溶液的折射率取为1.33(生物细胞的折射率范围是1.33～1.38)，则玻璃/界面处的临界角为61.74°。即当光线从玻璃中射入溶液中时，入射角大于61.74°时就会发生全反射。 隐失波 从几何光学的角度来看,当发生全反射时,光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上,由于波动效应,有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中,平行于界面传播。这部分光就是所谓的隐失波。隐失波是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，在平行界面方向以平行波场方式传播而在垂直界面方向则是呈指数衰减。透射强度和浸透深度公式如公式（3）所示。由公式知，对于可见光波长而言，浸透深度为～100nm。 图1 全内反射现象 ??? （3） T12（θi）是分界面处的透射强度,d 12是渗透深度，θi是入射角，λ是入射光波长  全内反射荧光显微镜 到目前，科学家们已经发展了多种全内反射荧光显微成像系统。其中最为普遍的两种类型是棱镜型和物镜型。（如图2所示）棱镜型成像系统的隐失场是通过入射光经棱镜发生全反射产生的，而物镜型的是通过入射光经物镜本身全反射产生。隐失波