2017届高中生物专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离课件新人教版选修1.pptVIP

一 二 知识精要 典题例解 迁移应用 知识架构 电泳方法 一 二 知识精要 典题例解 迁移应用 知识架构 二、凝胶色谱法的操作流程 一 二 知识精要 典题例解 迁移应用 知识架构 一 二 知识精要 典题例解 迁移应用 知识架构 【例2】 下列关于红细胞的洗涤过程的叙述,正确的是(　　) A.低速长时间离心,如500 r/min,12 min,以保证达到很好的分离效果 B.离心后用胶头吸管吸出下层透明的红色血浆 C.将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯,再加入五倍体积的蒸馏水 D.直至上清液中没有黄色,表明红细胞已洗涤干净 解析：红细胞洗涤过程中,应做低速短时间离心,以避免白细胞、淋巴细胞等一同沉淀,影响血红蛋白的提纯;离心后血浆在上层,并呈现为黄色,需用胶头吸管吸出;洗涤红细胞时应用生理盐水而不用蒸馏水,否则,将导致红细胞破裂影响实验结果。因此A、B、C均错误。 答案：D 一 二 知识精要 典题例解 迁移应用 知识架构 易错突破 合作探究 自主预习 易错突破 合作探究 自主预习 易错突破 合作探究 自主预习 易错突破 合作探究 自主预习 易错突破 合作探究 自主预习 目标导航 预习导引 目标导航 预习导引 一 二 一、分离蛋白质的原理与方法 1.分离蛋白质的原理 2.分离蛋白质的方法 (1)凝胶色谱法 ①概念:根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法,也叫分配色谱法。 目标导航 预习导引 一 二 ②过程及原理 b.分离的过程 目标导航 预习导引 一 二 c.分离原理:依据相对分子质量的不同而将蛋白质分离。 (2)电泳法 ①电泳的概念:指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 ②原理:利用了待分离样品中各种分子的带电性质的差异、分子本身的大小以及形状的不同,使带电分子在电场中产生不同的迁移速度,从而分离样品中的各种分子。 ③分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中后者使用时通常加入带负电荷多的SDS,形成“蛋白质-SDS复合物”,使蛋白质迁移速率仅取决于分子的大小。 3.缓冲溶液 (1)组成:通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例,可配制不同pH的缓冲液。 (2)作用:抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变。 目标导航 预习导引 一 二 缓冲溶液中含对酸碱起缓冲作用的缓冲对,每一缓冲对均由弱酸和相应的强碱盐组成。细胞外液也有酸碱缓冲对,你能回忆并说出细胞外液中的酸碱缓冲对吗? 提示：细胞外液中主要的酸碱缓冲对有:H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等。 目标导航 预习导引 一 二 二、凝胶色谱法的实验操作 1.蛋白质的提取和分离步骤 (1)样品处理 血红蛋白的释放:红细胞在蒸馏水和甲苯作用下破裂,释放出血红蛋白 分离血红蛋白溶液:混合液离心→过滤去除脂溶性沉淀层→用分液漏斗分离 目标导航 预习导引 一 二 (3)纯化:凝胶色谱法。 (4)纯度鉴定:SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。 目标导航 预习导引 一 二 2.凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作。 (2)凝胶色谱柱的装填。 固定:将色谱柱垂直固定在支架上 ↓ 装填:将用蒸馏水充分溶胀后的凝胶配成凝胶悬浮液,一次性缓慢倒入色谱柱内,装填时可轻轻敲动色谱柱,使凝胶装填均匀 ↓ 洗脱:装填完后,立即用缓冲液洗脱瓶,在约50 cm高的操作压下,用300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L 的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分洗涤平衡凝胶12 h? 目标导航 预习导引 一 二 (3)样品的加入与洗脱。 ①加样前:打开下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口。 ②加透析样品。 调整缓冲液面:与凝胶面平齐 ↓ 滴加透析样品:用吸管将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端 ↓ 样品渗入凝胶床:加样后,打开下端出口,等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口 ↓ 洗脱:打开下端出口,用 20 mmol/L的磷酸缓冲液洗脱? 目标导航 预习导引 一 二 ↓ 收集:待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每5 mL收集一管,连续收集? 3.操作提示 (1)红细胞的洗涤:洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀,达不到分离效果。 (2)色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀,可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热,加速膨胀。 (3)凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。 (4)蛋白质的分离:如果红色区带均匀一致地移动,说明色谱柱制作成功。 目标导航 预习导引 一 二 (1)凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱都装填有不能通过“柱”下端多孔板(或多孔筛