1-2酶分离纯化-1案例.ppt

第五节 酶的分离纯化 酶的提取与分离纯化 将酶从细胞或发酵液中取出，再与杂质分开，获得所需的酶产品。 酶的分离纯化工作,是酶学研究的基础. 酶的纯化过程就目前而言,还是门实验科学. 酶的纯化过程与一般蛋白纯化过程相比有本身独有的特点:一是特定的一种酶在细胞中含量很少;二是酶可通过测定活力的方法加以跟踪. 一 细胞破碎（link) 二 酶的提取 (link) 三 离心分离(link) 四 过滤与膜分离(link) 五 沉淀分离(link) 六 层析分离 七 电泳分离 八 萃取分离 九 酶的结晶 十 浓缩与干燥 一 细胞破碎 大多数酶存在于细胞内，需破碎后才能提纯 细胞不同，结构不同，所用的破碎方法和条件有所不同 细胞的破碎方法： （一）机械破碎法 link （二）物理破碎法 link （三）化学破碎法 link （四）酶学破碎法 link 原理：机械运动所产生的剪力作用于细胞 1 机械捣碎法：捣碎机，10000rpm，实验、生产规模 均可 2 研磨法：研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械， 效率较低 3 匀浆法：匀浆器，用于颗粒细小的组织细胞 破碎程度高。对酶破碎少，难于工业化。 包括: 1、温度差破碎法; 2、压力差破碎法; 3、超声波破碎法; 2、压力差破碎法 高压冲击法 用活塞或冲击锤加高压冲击菌体细胞和冰晶石英沙等混合物。 突然降压法 加压至30MP以上，打开出口阀突然降为常压 爆破性减压法 用氮气或二氧化碳充压至几十至几百大气压。 渗透压差法 利用渗透压的变化而使细胞破碎，常用于从海洋微生物中提取某些酶。 频率 10~20KHz，功率100~150W，温度0~10oC， pH4~7，时间3~10min，间隔多次;对数生长期细胞，细胞浓度和溶液粘度不宜太高。暴露于9～10kHz声波或10～500kHz超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便.且效果也好，但一次处理量较小;应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在;处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。 将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。 比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取羧肽酶。 自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30℃左右较早溶化。 自体融解过程中PH显著变化，随时要调节pH。 自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。 适宜的自溶条件：温度、pH值、离子强度等 加入噬菌体感染细胞 电离辐谢 二 酶的提取 是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。也称酶的抽提。 大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。 稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。 盐溶现象: 在一定浓度的盐存在下,酶的溶解度增加. 盐析现象: 当盐的浓度太高,蛋白的浓度反而下降,从溶液中析出.一般采用稀盐溶液，0.02~0.05mol/L。 等渗盐溶液尤以0.02～0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L碳酸氢钠液提取等。 三 离心分离 离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、密度的物质分离的技术； 要根据欲分离物质及杂质的大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 四 过滤与膜分离 过滤 借助过滤介质将大小不同，形状不同的物质分离的技术 介质有滤纸、纤维、陶瓷、高分子膜等。 以膜为过滤介质的过滤称膜分离技术； 微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析都属于膜分离技术 表1-2 过滤的分类与特性（P16） 一、非膜过滤 截留颗粒直径大于2μm,用于分离酵母、霉菌、动植物细胞、培养基残渣等。过滤介质有滤纸、滤布、多孔陶瓷等。 (1)常压过滤 以液位差为推动力，易操作，分离效果差，难成规模。 (2)加压过滤 以压力泵或压缩空气为推动力。效果较好，生产上应用广泛。 (3)减压过滤 真空过滤、抽滤。多用于粘性不大的物料。 超滤(续) 超乎寻常的膜通量，且维持恒定 适合处理高粘度、高含固量料液 浓缩倍数极高，可使浓缩液呈糊状 消除浓差极化，不易堵塞，易清洗 系统可逐级拓展，中试结果完全适用于生产规模 (3)反渗透 反渗透（RO）是膜分离技术的一个重要组成部分 膜孔径小于20 ? ，操作压力为0.7～1