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液相色谱基本常识 一．色谱法的原理 利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。 两相中有一相是固定的,叫作固定相,也就是咱们的色谱材料；有一相是流动的,称为流动相,流动相又叫洗脱剂。 二．色谱类型 1.按流动相的物态分 气相色谱(Gas Chromatography, GC)-用气体作为流动相(又叫载气)。 液相色谱(Liquid Chromatography, LC)-用液体作为流动相(又叫洗脱剂)。 2.按固定相的形态分: （1）平面色谱：纸色谱、薄层色谱。 （2）柱色谱 三．定义 1.定义 高效液相色谱法：是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段。 组成：高性能色谱柱，高精度输液泵，高灵敏度检测器 2.特点 优点：高效(60000理论塔板/米)、高速(1~10mL/min)、高灵敏度（微升数量级），高压(150~300kg/cm2)、高精度、高自动化 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 缺点：仪器设备价格昂贵 3.高效液相色谱柱发展史 19世纪70年代中期，HPLC仪开始出现，主要填料：10 μm 的无定型硅胶颗粒。 70年代后期，发展了反相液相色谱。 80年代，HPLC 被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5 ～ 10μm 球形硅胶。 90年代早期，粒径为5 μm 的高纯硅胶，即所谓的B 型硅胶被发展，并成为这个行业填料的标准，这种B 型硅胶含有微量的金属。 90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了3 μm 或3.5 μm 的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。 21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于2 μm 的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。 目前，市场上流行的分析用的HPLC 硅胶基质填料主要为B 型硅胶。 4. 高效液相色谱柱的基质材料 （1）硅胶 优点：目前应用最为广泛的基质材料。 高机械强度和高的比表面积。 可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。 重现性好。 pH 适用范围为pH 2－8。 缺点：具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。 （2）聚合物：交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯 优点：pH 稳定性好：pH1－13。 可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。 在中等pH 条件下对强碱性物质具有更好的峰形。 缺点：填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。 分离效率相对硅胶而言比较低。 重现性不好。 5.色谱柱的分类 常见的分配柱填料：碳十八柱（ODS/C18)、碳八柱（MOS/C8）、碳六柱（Hexyl/C6）、碳四柱（Butyl/C4）、碳一柱（Methyl/C1）、阴离子交换柱（SAX)、阳离子交换柱（SCX）、苯基柱（Phenyl）、氨基柱（Amino/NH2）、氰基柱（Cyano/CN/Nitrile） 常见的吸附柱填料：硅胶柱、氰基柱、氨基柱 HPLC色谱操作注意事项 1．流动相 （1）流动相应选用HPLC试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液 需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范 围； （2）流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 （3）水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质； （4）使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流 动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、 C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相； 2.样品 （1）样品必须经过0.45μm或0.22μm的滤膜过滤，确保样品中不含固 体颗粒； （2）用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为 正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动 相制备样品液； （3）手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为 定量管的3～5倍； （4）每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂(如甲醇)等清洗进样器。 3．色谱柱 （1）使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围， 如pH值范围、不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样 品； （2）连接色谱柱时，应注意连接方向，防止反接、反冲色谱 柱； （3）使用保护柱； （4）长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注 意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)。 （5）常规C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 （6）不要高压冲洗柱子； （7）不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；使用过程中注意轻拿轻放。 4.操作过程 1．注意各流动相所剩溶液的容积设定