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精益生产 智能管理 ———HPLC测定蛋白质含量方法确认 发言人：程红波 日期：2016-3-15 方法确认（HPLC法） 目的：证明HPLC方法适合于重组人粒细胞 刺激因子蛋白质含量检测要求 依据：《中国药典》2015年版 洗脱梯度（2015年版中国药典） 按下表进行梯度洗脱 编号 时间/分 A/% B/% 1 0 60 40 2 40 20 80 3 45 0 100 4 50 60 40 5 60 60 40 A：0.1%三氟乙酸的水溶液 B： 0.1%三氟乙酸的乙腈溶液 含量计算公式 供试品蛋白质含量（ug/ml)= CR×AX×nX AR×nR 式中 CR为复溶所得标准品溶液的蛋白质含量， ug/ml； AR为标准品溶液的平均峰面积； AX为供试品溶液的平均峰面积； nR为标准品溶液的稀释倍数； nX为供试品溶液的倍数； 方法比较（ lowry与HPLC） Folin-酚（lowry） HPLC 要求人为精确控制操作时间 设备控制时间，减少人为误差 操作复杂，干扰因素较多 操作简便，干扰因素较少 重复性、精密度较差 重复性、精密度较好 只适用于检测原液的蛋白质含量 适用于原液及成品的蛋白质含量 / 2015年版《中国药典》首次规定的检测方法 方法比较（lowry与HPLC） 批序号 lowry法（ug/ml) HPLC法(ug/ml) 原液批1 1477 1417 原液批2 1393 1358 原液批3 1432 1379 原液批4 1466 1413 原液批5 1389 1327 原液批6 1456 1415 原液批7 1395 1352 原液批8 1428 1386 结论：lowry法与HPLC法所测得的浓度存在一定的差异！ 色谱图比较 工作标准品色谱图例 供试品色谱图例 25.757 25.688 重复性实验（出峰时间） 批序号 类别 规格（ug/ml） 平均峰出峰时间 RSD值(%) / 标准品 75 25.546 0.057 / 标准品 150 25.537 0.038 / 标准品 300 25.535 0.023 原液批1 供试品 300 25.541 0.050 成品批1 供试品 75 25.544 0.048 成品批2 供试品 150 25.506 0.033 成品批3 供试品 300 25.594 0.040 实验结论：RSD值﹤1%，符合2015年版《中国药典》要求 重复性实验（峰面积） 实验结论：RSD值﹤1%，符合2015年版《中国药典》要求 批序号 类别 规格 平均峰面积 RSD值 / 标准品 75ug/ml 4406.24 0.08% / 标准品 150ug/ml 4610.70 0.13% / 标准品 300ug/ml 4722.04 0.53% 原液批1 供试品 300ug/ml 4749.36 0.52% 成品批1 供试品 75ug/ml 4559.72 0.58% 成品批2 供试品 150ug/ml 5063.89 0.23% 成品批3 供试品 300ug/ml 5372.14 0.40% 精密度实验（出峰时间） 批序号 类别 规格（ug/ml) 平均峰面积 RSD值（%） 分析员A 分析员B 分析员A 分析员B / 标准品 75 25.511 25.534 0.032 0.056 / 标准品 150 25.537 25.567 0.077 0.061 / 标准品 300 25.561 25.581 0.062 0.033 原液批2 供试品 300 25.554 25.544 0.035 0.047 成品批4 供试品 300 25.538 25.536 0.035 0.048 成品批5 供试品 150 25.579 25.667 0.064 0.073 成品批6 供试品 75 25.564 25.818 0.059 0.043 实验结论：RSD值﹤2%，符合2015年版《中国药典》要求 精密度实验（峰面积） 批序号 类别 规格 （ug/ml) 平均峰面积 RSD值（%） 分析员A 分析员B 分析员A 分析员B / 标准品 75 3660.26 3677.38 1.30 1.11 / 标准品 150 3715.15 3722.89 1.27 0.97 / 标准品 300 3478.19 3500.13 0.93 1.59 原液批2 供试品 300 3424.81 3434.33 1.84 1.06 成品批4 供试品 300 4513.68 4538.38 1.28 0.99 成品批5