chapter07蛋白质的分离、纯化和表征技巧.ppt

第七章 蛋白质的分离纯化 四、蛋白质分离纯化的基本原则 1、前处理：匀浆、捣碎及超声破碎，离心分离 组分 2、粗分离：盐析，等电点沉淀，有机溶剂沉淀， 超滤 3、细分离：凝胶过滤，离子交换层析，亲和 层析，电泳等 超声破碎仪 超滤装置 凝胶过滤的工作原理 （二）根据溶解度差别： 1、等电点沉淀法：等电点时蛋白质溶解度最低，不同蛋白具有不同等电点。 2、盐析法: 最先聚集沉淀的是表面疏水残基最多的蛋白质。 3、有机溶剂法：不同蛋白质沉淀要求的有机溶剂浓度不同。 （三）根据电荷不同： *离子交换层析 蛋白质的定量法 克氏(Kjeldahl)定氮法: 浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3 双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合 Folin-Phenol法: BCA (bicinchoninic acid)法: FDA唯一认可 Bradford法: 考马斯亮兰 ( Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化 紫外法: 280纳米处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) 习题 盐析作用 疏水相互作用 透析 *分离纯化蛋白质主要根据蛋白质的哪些性质 A 分子的形状和大小 B 粘度不同 C 溶解度不同 D 溶液的pH值 E 电荷不同 *蛋白质胶体溶液的稳定因素是： A 蛋白质颗粒在溶液中进行布朗运动，促使其扩散 B 蛋白质分子表面有水膜 C 蛋白质溶液粒度大 D 蛋白质分子带有同性电荷 凝胶过滤法测定蛋白质分子量是根据不同蛋白质带电荷多少进行的。 用透析法可解开蛋白质中的二硫键。 SDS测定蛋白质分子量的方法是根据蛋白质分子所带电荷不同。 习题 在水溶液中，蛋白质溶解度最小时的pH值通常就是它的等电点。 已知牛血清白蛋白含色氨酸0.58%(按重量算),色氨酸分子量为204。 (1)计算最低分子量； (2)用凝胶过滤测得牛血清白蛋白分子量大约为7万,问该分子中含有几个Trp残基。 一种酶分子量为360,000, 在酸性环境中可解离为二个不同成分, 其中一个成分分子量为120,000, 另一个为60,000. 大的占总蛋白的三分之二, 具有催化活性; 小的无活性. 用β-巯基乙醇处理时, 大的颗粒即失去催化活性, 并且它的沉降系数减小, 但沉降图案上只呈现一个峰. 关于该酶的结构可做出什么结论? Isoelectric focusing can be combined with SDSto obtain very high-resolution separations. A single sample is first subject to isoelectric focusing (separating by pI values) and then to SDS(separating by molecular mass) in a vertical direction to yield a two-dimensional pattern of spots. More than a thousand different proteins in E.coli can be resolved on a single gel by this method. Proteins can be effectively purified by affinity chromatography. This technique makes use of the binding capacity of many proteins for specific ligands (substrates, antigens, etc.) The specific ligands are usually covalently cross-linked to insoluble beads. Specific ligand-binding proteins are retained on the column (all other nonspecific proteins are washed away from the column with low salt buffers) when a mixture of proteins (cell extract) is applied. The specifica