2013-06-15承担单位福建省农科院农业生物资源研究所试验设计.doc

2013-06-15 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：IPTG浓度对Cry2Ab蛋白表达的影响 试验人员：许炼 试验负责：朱育菁、潘志针 报告日期：2013-07-14 计数月份：2013年月 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591 试验目的 苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis) 利用大肠杆菌进行原核表达，一个最基本的前提条件是要确保表达菌处于对数生长期，同时，诱导剂IPTG的浓度，诱导时间，诱导温度，转数等也是需要考虑的因素；此外，利用大肠杆菌表达外源基因常常形成不溶性的无活性包涵体，包涵体的形成已经成为研究和应用活性蛋白质生产的主要障碍[4,5]。总之，影响原核表达的因素非常多。 本实验克隆了福建省农科院分离的具有高毒力的Cry2Ab基因，通过。试验方法 含有重组质粒pET30-a(+)-Cry2Ab的BL21。 Kanamycin-LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，去离子水定容至于1000 mL，灭菌后卡那霉素至终浓度为35μg/ml4℃保存。 APS(电泳级)、TEMED（电泳级）、IPTG购自泰京生物技术有限公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺酵母提取物和胰化蛋白胨购自OXOID公司 2.1.4 仪器 PowerPac垂直电泳仪（BIORAD），Centrifuge 5418R（。 2.2.1 BL21菌体蛋白的获取 晚上将含有pET30-a(+)-Cry2Ab重组质粒的BL21菌液10μL接种到10mL LB-KANA液体培养基，180rpm、37℃过夜。第二天吸取00μl菌液，重新接种到mL LB-KANA液体培养基，220rpm、37℃培养3h，此时菌液的OD值约在0.6-1.0之间。分成两，菌液000rpm离心3min，菌体加μl 2×loading buffer和μl的去离子水，混匀后煮沸10分钟。1000rpm离心10min，收取含有蛋白的上清，分装成20μl后-80℃存储。SDS检测Cry2Ab蛋白 带有H标签分子量在65-70KD，10%浓度的分离胶。μL作为上样量。 浓缩胶和分离胶的配方如下： 浓缩胶 去离子水 1.9mL 30%Acr-Bis 1.7mL 1.5mol/L Tris-Hcl，PH 8.8 1.3mL 10%SDS 50μL 10%AP 50μL TEMED 3μL Total 5mL 分离胶（10%） 去离子水 1.4mL 30%Acr-Bis 0.33mL 1.5mol/L Tris-Hcl，PH .8 0.25mL 10%SDS 20μL 10%AP 20μL TEMED 3μL Total 2mL 试验结果图 M: marker，1: 0mM IPTG，2: 0.2mM IPTG，3: 0.4mM IPTG，4: 0.6mM IPTG，5: 0.8mM IPTG，6: 1mM IPTG 图 M: marker，1: 0mM IPTG，2: 0.2mM IPTG，3: 0.4mM IPTG，4: 0.6mM IPTG，5: 0.8mM IPTG，6: 1mM IPTG 通过实验可以看出，IPTG的浓度效应对Cry2Ab蛋白的表达几乎没有影响，低浓度的IPTG便能诱导Cry2Ab的表达，和诱导3小时相比，诱导6h菌体蛋白明显增加（上样量均为1